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氮、磷对青岛大扁藻生长的影响
陈庆荣 林长顺
（宁德市蕉城区水产技术推广站,福建宁德 352100）
[摘 要] 本实验以按绿藻培养液配方出的基础培养液,设置2组N、P比例,通过室内光照培养箱培养青岛大扁藻,探讨氮、磷对青岛大扁藻生长的影响.结果显示：在25℃、5000lx的条件下,当氮磷源充足的情况下,青岛大扁藻生长的最佳氮磷比例为7.17：1；在氮磷营养盐条件受到限制的情况下,13.75∶1是青岛大扁藻生长较为理想的氮磷比.
[关键词] 青岛大扁藻 氮磷比 相对增长率 生物量
[中图分类号] S917 [文献标识码] A [文章编号] 1003-1650(2017)04-0063-02
引言
海洋微藻具有生化合成高不饱和脂肪酸（PUFAs）的能力,因此备受到重视.微藻可作为浮游动物（轮虫,枝角类等）、甲壳类、双壳类和幼龄鱼类的饵料而在海水养殖业中占有重要地位.对许多水产动物来说,饵料中含有丰富的不饱和脂肪酸,尤其是鱼虾类生长所必需的脂肪酸（EFA）,能够提高其生长率和幼体的存活率,对人类心血管系统疾病也有防治的效果,以及在养殖业中作为一些浮游动物（轮虫等）的单细胞饵料[1].
扁藻是一种海生团藻类,能游动的单细胞绿藻.生长在沿海石沼及静水港湾海水里,但适应范围很广,在盐度8-80的水中均能生长繁殖,最适盐度范围为30-40之间.扁藻具有广温性,在7-30℃范围内均能生长繁殖,最适温度范围大约在20-28℃.
青岛大扁藻属绿藻门,绿藻纲,团藻目,衣藻科,扁藻属.青岛大扁藻的典型形状为长圆形,扁平而又腹背之分,体长在16-30μm,一般是20-24μm,宽12-15μm,厚7-10μm,体形左右对称,前端较宽阔,顶端全部凹陷,尾部略窄或略尖,藻体上有一背腹沟,从沟中长出四根鞭毛,每两根一组顶分生左右.其淀粉核有极性,极向对着鞭毛,眼点2-3个,少数有4个.眼点位于淀粉核邻近,细胞长15-17μm,故在一般低倍镜下就能看得很清楚.
大扁藻可作为海产品幼体前期的优质植物性饵料,对海产品幼体的生长发育有着极其重要的作用.氮、磷是影响和限制藻类生长的主要限制性营养盐因子,也是水体富营养化的重要来源.通常认为浮游植物正常生长时所需要C：N：P的原子比率为106：16：1.但由于藻类生态习性不尽相同,导致对营养物质的需求也不相同,并且受所处环境条件的影响.就氮、磷浓度对大扁藻生长的影响进行研究,以期为大批量生产大扁藻提供参考.
1 材料和方法
1.1 主要仪器
V-1100型可见光分光光度计；恒温光照培养箱、电热恒温鼓风干燥箱；立式压力蒸汽灭菌器.
1.2 藻种的提纯与培养
试验用的青岛大扁藻购于连江县良种繁育中心.
首先需要对大扁藻进行提纯,琼脂平板法对分离能够运动的鞭毛型绿藻类最为适宜,琼脂平板法又分为划线接种法、喷雾接种法和小水滴扩散法.该实验采用平板划线法,在无菌操作台上操作.选用配方配制培养基,加入1.8%的琼脂,加热培养液,不断搅拌,使琼脂全部熔化,加盖,与空培养皿一起至于立式压力蒸汽灭菌器中灭菌.灭菌完全后,在无菌台上将培养液分装于培养皿中,厚1.5cm左右,加入少量无菌蒸馏水,冷却备用.将接种环在酒精灯上消毒彻底,待冷却后,在高浓度的藻液里勾取少量藻液,在提前制备好的琼脂板上划线,加盖,置于光照培养箱中培养,待藻落形成,在无菌操作台上接种到提前配好的小量营养液中,反复多次就能得到“单种”微藻——青岛大扁藻.
试验时取用对数生长期的藻液.培养所需海水取自三都澳海区自然海水,经煮沸24分钟,静置1天后配成海水营养盐. 基础培养液, 其主要成分是NaNO3 10mg/L,KH2PO4 1mg/L,Na2SiO3 1mg/L,FeC6H5O7·5H2O 0.1mg/L,维生素B1 200ug,维生素B12 200ng.
取藻液若干加入到高温灭菌的锥形瓶,然后加入大成培养液100mL.藻液与培养液的体积比为1∶5,放进光照培养箱内培养9d,光照周期设为12L：12D,温度设置为25℃,光照设置为5000Lx,每天摇瓶数次.并将各三角瓶随机放置,以期减少光强对藻类生长的影响.所用的实验器皿均先经过121℃ 、50 min高压灭菌,冷却后使用.
1.3 指标测定及方法
1.3.1 藻类细胞生物量测定 本次藻细胞生物量测定采用光密度法,光密度法是利用微藻在某一波长下的光吸收值来测定细胞密度的方法,即根据藻液吸光度与细胞数的相关关系,求出它们的回归方程.然后根据测得的藻液的吸光度,用回归方程计算细胞数,具有操作方便的优点.首先用细胞计数法获得藻液的初始密度.即取一定量浓度的试验藻种进行血球计数板计数,计数时,取一定体积的藻液,用碘液将藻细胞杀死,摇匀后,用毛细吸管吸取样品,从盖玻片的一侧慢慢吹入计数池内,不使有气泡产生,静置1-2分钟,在显微镜下计数得到初始浓度的藻类细胞的数量级.
1.3.2 相对生长率测定 设置若干氮、磷比例,每一比例下设置2个重复,培养温度为25℃、光照周期为12L： 12D的白光下进行培养,每天早晚各摇瓶1次,4d后取出,分别测定其相对增长率.大扁藻相对增长率按公式方法计算, 公式为：K等于Lg（Nt/N0）/T式中, N0为起始细胞密度,Nt为t时刻细胞密度,T为培养时间.
1.3.3 试验设计与方法 取用对数期的藻液,接种时藻种的初始密度为3.66×104cell/ml.
整个试验以培养液原液为基础,氮盐和磷盐浓度则根据试验要求设计的条件下改变N 和P浓度设立不同营养处理组.实验分为2组（A组和B组）,A组保持磷质量浓度不变,逐渐增加氮浓度,共设置5个不同浓度；B组保持氮质量浓度不变, 逐渐增加磷浓度,也设置5个不同浓度.实验温度25℃,光暗比为12 h ∶12 h ,光照强度为5000lx.每组2个平行.培养液中除硝酸盐和磷酸盐浓度自行设置外,其它组分同培养液原液的浓度.本实验设定的氮、磷浓度均在假设培养液中的氮、磷浓度为零的前提下.
2 结果与分析
2.1 藻细胞生物量对应吸光度线性关系的构建
将表3的数据用进行曲线拟合,可得藻细胞生物量与吸光度的线性相关系数最高,R2为0.998,回归系数的方差值F等于2005.506,sig.等于0.000<0.01,综合线性影响差异极显著,表明系数的误差检验具有统计学意义.藻细胞生物量对应吸光度线性拟合方程Y 等于 b1*X+ b0为描述藻细胞生物量与吸光度关系的最优方程,代入待定系数所求得曲线方程可得藻细胞生物量对应吸光度线性拟合工作曲线：C（cell/ml） 等于 36.695×A680nm-0.267,自变量即吸光度A680mm的区间在（0.034,0.200）之间,C为藻细胞浓度,单位×104cell/ml.由此得到一条标准曲线,用以快速测得青岛大扁藻的生物量,如图1.
2.2 氮、磷浓度对藻细胞生物量的影响
由图2可以看到,在磷源充足的情况下,不额外添加氮源的情况下,大扁藻依靠海水中原有氮源不断生长,但长速相对缓慢；额外添加氮源浓度为0.41mg/L的情况下,大扁藻在接种后的前3天长速最快,之后细胞部分死亡,再缓慢增长；额外添加氮源浓度为0.82mg/L的情况下,大扁藻的生长呈阶梯式增长,在接种后第8天,由于氮源的限制,部分细胞开始死亡；额外添加氮源浓度为1.65mg/L的情况下,大扁藻的生长呈现更大幅度的阶梯式增长,且长势良好；额外添加氮源浓度为3.29mg/L的情况下,大扁藻在接种后前4天内生长缓慢,之后快速增长.
由此可见,接种后6天内给予大扁藻0.41mg/L的氮源（氮磷比值为1.78）可保持其较快的生长速度,之后再补充氮源,可使其保持较长时间的快速增长.
由图3可以看到,在氮源充足的情况下,前3天不同磷浓度下的生长曲线比较接近,差异较小.
由此,可以判断,在大扁藻生长的前期对磷源的要求比较高,但过高的磷浓度不能使其以较快的速度增长,后期需求较小.即前期（1-6天）施加0.12mg/L磷源（氮磷比值为13.75）,后期少量增加可使大扁藻保持较长时间的快速增长.
图5为相同配方比例的两条曲线,即氮磷浓度均与大成培养基一致,氮磷比值为7.17.可能由于三角烧瓶随机放置受光照影响的关系,表现出一定的差异,但都呈现同样向上的增长趋势.
图5为相同氮磷比下,A组氮源不足,磷浓度与大成培养基一致,B组磷过量,氮浓度与原基液一致,氮磷比值为3.57.该条件下,两者前期的波动比较一致,后期B组呈现出持续的增长.由图3我们知道,磷浓度在0.12mg/L的情况下,即可满足大扁藻的生长,由此可以判断,出现这样的情况是受氮浓度的影响,即在磷源充足的情况下,大扁藻的生长受氮浓度的限制,在前期,生物量较小,需求相对较小,差别不大,到后期,生物量达到一定程度,氮浓度成为生长的限制因素.
表5、表6为第四天,不同氮磷浓度下大扁藻的相对增长率.由表可知,在磷源充足的情况下,当氮浓度为0.041mg/L,大扁藻第四天的相对增长率最大；在氮源充足的情况下,当磷浓度为0.12mg/L,大扁藻第四天的相对增长率最大,与上述结果一致.
本实验数据表明当磷源受到限制的情况下大扁藻最佳氮磷比例为1.78：1,而当磷源充足的情况下,大扁藻生长的最佳比例为13.75：1.
3 讨论
3.1 氮、磷营养盐浓度对青岛大扁藻生长的影响
氮是构成蛋白质的主要元素,而蛋白质是一切生物的物质基础,所以氮对大扁藻具有特别重要的意义.磷主要存在于微藻细胞的原生质和细胞和中,也是构成蛋白质不可缺少的元素之一.
由以上实验结果可知,当添加的氮浓度在较低水平时,即TN<1.65mg/L时,大扁藻生长前期,生物量小,对氮的需求不高,此情况下,氮浓度的增加对其生长的影响不大,后期大扁藻生物量达到一定程度,对氮的需求较大,此时,其生物量随着氮浓度增加而增加.
当添加的磷浓度较低时,即TP<0.23mg/L时,由于自然海水中存在一定浓度的磷源,且扁藻刚开始生物量小,对磷的需求同样不高,此情况下,磷浓度的增加对其生长的影响不大,后期大扁藻生物量达到一定程度,对磷的需求相对有所增加,此时,总的趋势是大扁藻的生物量随着磷浓度的增加而增加. 实验指出,在不同磷质量浓度条件下,藻类生长的最佳条件是磷浓度等于0.07 mg/L,且在磷浓度大于0.07 mg/L时,藻类生长状况要优于磷浓度小于0.07 mg/L时.本实验最适合青岛大扁藻生长的磷浓度为0.12mg/L,且在浓度大于0.12mg/L时,大扁藻的生长状况要优于磷浓度小于0.12mg/L时,与上述研究相似.
4 结论
实验表明当氮磷源充足的情况下,青岛大扁藻生长的最佳比例为7.17：1；在氮磷营养盐条件受到限制的情况下,13.75是大扁藻生长较为理想的氮磷比值.
这表明大扁藻的生长状况,不仅决定于氮、磷等营养盐初始浓度,而且也与氮磷营养盐之间的比例关系密切相关.
参考文献
[1]曹春晖,孙世春,麦康森等.氮浓度对四株海洋绿藻总脂含量和脂肪酸组成的影响[J].海洋湖沼通报,2006（3）：79-84.
[2]广西壮族自治区东兴各族自治县珍珠场试验组.扁藻培养的一些问题及其处理[J].水产科技情报,1977（5）：42-43.
[3]单细胞藻类之--扁藻[EB/OL].2007-6-2/2012-4-25.
http：//baike.baidu.com/view/776011.htm.
[4]张学超,杨立平,刘缵延等.对虾育苗中常用海洋微藻抑菌作用的研究[J].水产科学,2010,29（2） ：112-114.
作者简介：陈庆荣（1969-）,男,工程师,从事水产养殖研究,E-mail：973785055@.com
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