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全自动固相萃取高效液相色谱测定蔬菜中灭蝇胺残留

摘 要:建立了全自动固相萃取- 高效液相色谱测定蔬菜中灭蝇胺的方法.样品切碎后,用甲醇- 水溶液(9 ∶ 1,V/V) 匀浆提取,提取液经全自动固相萃取仪净化,采用反相高效液相色谱分离,外标法定量.本法线性范围为0.05 ~ 2.0 mg/L,方法检出限为0.02 mg/kg.本文优化了固相萃取条件,通过全自动固相萃取法和手动固相萃取的比较可以看出,全自动固相萃取法的精密度优于手动固相萃取法.

关键词:全自动固相萃取仪;高效液相色谱;灭蝇胺

Abstract:This paper reports an automatic solid phase extraction and HPLC method for the determinationof Cyromazine in vegetable. Samples were extracted with methanol-water(9∶1, V/V), cleaned up on automaticsolid phase extraction, separated by RP HPLC and the external standard method was quantified. The methodshowed a linear range of 0.05 ~ 2.0 mg/L and a limit of detection of 0.02 mg/kg. The conditions of automaticextraction were optimized in this paper. By comparing the results of automatic solid phase extraction andmanual solid-phase extraction, it can be seen that the accuracy of automatic solid phase extraction is betterthan that of manual solid-phase extraction.

Key words:Automatic solid-phase extraction;HPLC; Cyromazine

中图分类号:O657.63;TS255.7

灭蝇胺(Cyromazine),化学名称N- 环丙基-1,3,5- 三嗪-2,4,6- 三胺,是一种三嗪类有机化合物.灭蝇胺有很好的选择性,主要对双翅目类昆虫有活性.其机理是使双翅目类昆虫幼虫及其蛹在形态上发生畸变,成虫羽化不全或受抑制.主要用于防治叶菜类、菜豆类和瓜果类的美洲斑潜蝇和潜叶蝇等农业害虫.灭蝇胺以其高效、低毒性、低残留、持效期长等特点,得到了世界范围内的认可,目前已经广泛应用于蔬菜蝇蛆的防治.GB 2763-2016《食品中农药最大残留限量》中规定灭蝇胺的限量指标:黄瓜中的最大残留限量值为1.0 mg/kg,其他豆类蔬菜限量值为0.5 mg/kg.目前,灭蝇胺检测方法主要有HPLC 法、HPLCdoiMS/MS 法和GC-MS 法,样品前处理方法则基本都采用固相萃取法,而手动固相萃取操作存在自动化程度低、处理能力有限、重现性差等缺陷.本文采用全自动固相萃取仪进行萃取操作,相对于传统的手动固相萃取方式,全自动固相萃取法降低了样品用量,实现了样品的自动化在线前处理,既节省了时间,又避免了操作人员直接接触有机溶剂.同时,操作简便,减少人为因素引入的误差,重现性好,大大提高了分析效率.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器:岛津LC20A 高效液相色谱仪,配有M20A二极管阵列检测器;Sepline-s1 全自动固相萃取仪,北京莱伯泰科仪器股份有限公司;HZF-A500 电子天平,福州华志科学仪器有限公司;均质机,T18 德国IKA公司;MV5 多通道平行浓缩仪,北京莱伯泰科仪器股份有限公司.

试剂:SCX 固相萃取柱,6 mL,500 mg, 上海安谱实验科技股份有限公司;Florisil 固相萃取柱,6 mL,500 mg,上海安谱实验科技股份有限公司;灭蝇胺,纯度98.0%,德国Dr .Ehrenstorfer 公司;乙腈、甲醇,色谱纯,上海安谱实验科技股份有限公司;氨水、盐酸,分析纯,西陇化工股份有限公司;水,高纯水.

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

灭蝇胺标准储备溶液(100 mg/L):准确称取灭蝇胺标准品10 mg(精确至0.1 mg),置于100 mL 容量瓶中,加入乙腈定容至刻度.分别吸取标准储备溶液50 μL、100 μL、200 μL、0.5 mL、2.0 mL 于100 mL 容量瓶中,用乙腈定容.配制成浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.5、2.0 μg/mL 标准系列工作溶液[1].

1.2.2 样品的预处理及提取

将蔬菜样品取可食部分,擦去样品表面的附着物,切碎,充分混匀,捣成匀浆.匀浆放入聚乙烯瓶中于-20 ~ -16 ℃下保存.称取样品时,常温样品搅拌均匀,冷冻样品解冻后混匀取样.

称取匀浆样品20 g(精确至0.01 g)于250 mL 三角瓶中, 加入40 mL 甲醇- 水溶液(9 ∶ 1,V/V),高速均质2 min,滤液经垫有滤纸的布式漏斗抽滤至100 mL 具塞比色管中,再用25 mL 上述混合溶液清洗烧杯和均质器刀头,高速均质30 s,滤液经留有残渣的布氏漏斗抽滤,合并滤液于100 mL 具塞比色管中,加入8 mL 0.5 mol/L 盐酸,采用甲醇- 水溶液(9 ∶ 1,V/V) 定容,取出5 mL 提取液至试管中待净化[2].

1.2.3 提取液的净化及浓缩

按表1 中程序应用全自动固相萃取仪对样品提取液进行净化.净化后的提取液在平行浓缩仪上40 ℃吹干,用流动相定容至1 mL.

1.2.4 HPLC 分析条件色谱柱,Thermo Hypersil APS2(NH2) 氨基柱(250 mm×4.6 mm,5 μm); 流动相, 乙腈+ 水(97+3,V/V); 流速,1 mL/min; 柱温,30 ℃; 进样体积,10 μL;检测器,二极管阵列检测器;检测波长,210 nm[3].

2 结果与讨论

2.1 全自动固相萃取仪条件优化

2.1.1 固相萃取柱的选择

考虑到蔬菜样品中含有较多色素,而灭蝇胺为三嗪类弱碱性化合物,所以本文选择了Florisil 小柱和SCX 小柱对样品进行净化.实验表明,SCX 固相萃取柱对灭蝇胺的萃取效果较好,回收率较高,使用该型小柱所得萃取液干扰杂质较少.因为SCX 固相萃取柱键含有苯磺酸官能团,所以上样时,样品溶液pH 值会影响灭蝇胺在小柱上的吸附.本文通过在样品提取液中加入8mL 0.5 mol/L 盐酸溶液,将提取液的pH 值控制在2 ~ 3(不同基质pH 值稍有差别),以保证其带电荷,使灭蝇胺在洗脱之前能够更好地保留在小柱上.Florisil 小柱除去样品中的色素效果明显,但目标物灭蝇胺的回收率低于采用SCX 小柱时所得到的结果.应用两种固相萃取小柱净化的方法检出限没有数量级上的差别.综合考虑以上因素,本方法选择SCX 小柱作为净化柱[4].

2.1.2 固相萃取条件优化

由于叶菜类和豆荚类样品含有色素较多,当上样量太大容易使小柱穿透,本方法选择上样体积为5 mL.应用SCX 小柱进行净化时,保持目标物带有电荷可以更好地使目标物吸附在小柱上,有效提高回收率.实验中对不同淋洗液的淋洗效果进行了比对,在其他条件相同的情况下,分别采用0.1 mol/L 的盐酸和纯水作为淋洗液进行淋洗,对目标物回收率的影响并不明显.同时,考虑到溶剂的环境友好性,最终选择采用纯水进行第一次淋洗,再用甲醇进行第二次淋洗,用以除去提取液中的极性干扰物质.SCX 柱的洗脱液应为碱性溶液,一般为不同配比的氨水- 甲醇洗脱液[5].本文比较了5% 的氨水- 甲醇、10% 氨水- 甲醇、20% 氨水- 甲醇洗脱液,发现体积比为5 ∶ 95 时洗脱效果较好,回收率高.应用5 mL 上述5%的氨水- 甲醇洗脱液,洗脱3 次和洗脱两次的回收率分别为86% 和82%,为减少有机试剂的使用量,本文选择5 mL 5% 的氨水- 甲醇洗脱两次作为洗脱程序[6].上样流速和洗脱流速也会影响目标物回收率.上样速度太快,样品来不及与小柱作用就流出小柱,降低回收率.洗脱速度过快,洗脱溶剂没有时间和目标物充分接触,无法将样品从小柱上充分洗脱下来,也会降低目标物回收率.本文充分考虑上述影响条件,确定上样及洗脱的流速分别为1、2 mL/min[7].

2.2 线性范围及检出限

将标准系列工作溶液按1.2.4 色谱条件进行检测,以对应的色谱图峰面积为纵坐标(Y,响应值)、质量浓度为横坐标(X,μg/mL)进行回归分析.结果表明:灭蝇胺在浓度0.05 ~ 2.0 μg/mL 呈良好的线性关系,回归方程为Y等于9.09e-006X+0.007 5,线性相关系数(r)为0.999 5.方法检出限为0.02 mg/kg(信噪比RSN等于3).灭蝇胺的高效液相色谱图,如图1 所示[8].

2.3 加标回收率及精密度

选取黄瓜、土豆、豇豆3 种蔬菜,按1.2.2 及1.2.3进行加标实验[9].每种蔬菜选取中低高3 个浓度,每个浓度分析6 个样品,每个样品均应用手动和自动固相萃取两种净化方式,结果见表2.

3 结论本文建立了全自动固相萃取- 高效液相色谱测定蔬菜灭蝇胺残留方法.在加标回收实验中,应用手动固相萃取法,3 种蔬菜不同浓度加标值的RSD分别为:黄瓜,9.2、5.6、3.7;土豆,7.8、4.6、3.3;豇豆,7.2、4.4、3.1.应用全自动固相萃取法,3 种蔬菜不同浓度加标值的RSD 分别为:黄瓜,6.8、4.1、2.9;土豆,6.2、3.7、2.2;豇豆,5.9、3.5、2.7.可以看出,全自动固相萃取法所得结果对于同种蔬菜相同浓度加标值的精密度要优于手动固相萃取法,加标回收率没有明显区别.结果表明,本方法适用于各种蔬菜样品中灭蝇胺残留量的检验.该方法的样品前处理方式自动化程度高、操作简便,有机溶剂用量少,成本低,特别适用于高通量的样品测定,方法的可推广性强.

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作者简介:董 娇(1982—),女,硕士,工程师;专业方向为食品、矿石、金属材料检验分析.

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