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高通量法选育果胶酶高产菌株

马玮超,杜茂林,谷亚楠,等. 高通量法选育果胶酶高产菌株[J]. 江苏农业科学,2016,44(7):513-516.

doi:10.15889/j.issn.1002-1302.2016.07.146

高通量法选育果胶酶高产菌株

马玮超, 杜茂林, 谷亚楠, 郭彦昭, 薛婷婷, 陈五岭

(西北大学生命科学学院,陕西西安 710069)

摘 要:用深孔微培养-酶标仪检测替代摇瓶培养-紫外分光光度计检测,以期建立1种高通量选育果胶酶高产菌的方法.试验确立的最佳微培养条件为:转速280 r/min,振幅45 mm,装液量1.2 mL/孔.经统计软件分析表明:2种检测方法的检测值、酶产值间线性回归关系均极显著,且数值排序大致相同,表明用深孔微培养-酶标仪检测体系选育菌种是可行的.通过复合诱变(超声波处理40 min,紫外照射60 s),经过高通量筛选,得到4株高产菌.经传代培养后证明:C23-7、C23-9这2株菌遗传稳定,酶活效价均值分别可达705.7、695.0 U/mL,分别比出发菌株(477.3 U/mL)提高了47.85%、45.61%,适合应用.

关键词:果胶酶;高通量;复合诱变;超声波;紫外诱变

中图分类号: S182文献标志码: A

文章编号:1002-1302(2016)07-0513-04

收稿日期:2015-05-24

基金项目:陕西省重大科技创新项目(编号:2009ZKC04-16).

作者简介:马玮超(1990—),男,河南郑州人,硕士研究生,从事应用微生物研究.

通信作者:陈五岭,教授,研究方向为应用微生物.E-mail:1336479916@.com.

果胶酶被广泛应用于食品加工、纺织加工、造纸制浆、医疗卫生等领域[1-2],是世界四大酶制剂之一.目前果胶酶主要采用微生物发酵法大规模生产,具有较高的市场价值和应用价值.高效生产果胶酶具有十分重要的现实意义,而提高酶的产量,离不开高产菌种的选育.

目前,菌种选育的技术手段十分丰富,如原生质体杂交育种、不定向诱变、转基因定向育种等,大大提升了育种效果,但是与其配套的高效筛选方法却进展不大.

已报道的果胶酶高产菌种选育方法,多数仍为传统的平板筛选法[3-5].传统方法在初筛时,对诱变后菌液的梯度稀释过程中,很有可能遗漏高产正突变菌株,而且人工、设备消耗较大,效率低下.

建立1种可有效减少筛选遗漏、工作强度、材料消耗,提高工作效率的果胶酶高产菌选育方法,就成为亟待解决的问题.

1材料与方法

1.1主要材料与仪器

1.1.1出发菌株出发菌株为笔者所在实验室保藏的1株可产果胶酶的黑曲霉(Asperillus.spp)及其多个突变株.

1.1.2主要仪器SP-Max 2300A光吸收型全波长酶标仪;VIS-7220N紫外分光光度计;ZWY-200D摇床;Matrix EXP 6道移液器;TDZ5-WS孔板离心机;YLN-V紫外诱变箱;xrc-80AD超声波清洗器;孔板固定架;48孔矩形深孔板(4.6 mL).

1.1.3主要试剂果胶粉(Sigma公司,分析纯).DNS溶液为自行配制,储存于棕色容器避光保存1周后备用.

1.1.4培养基种子培养基:40 g果胶,10 g (NH)2SO4,38 g K2HPO4·3H2O,2 g KH2PO4,加蒸馏水定容到 1 000 mL,将pH值调至6.

发酵培养基:30 g蔗糖,2 g果胶,20 g(NH4)2SO4,3 g NaNO3,3.8 g K2HPO4,0.2 g KH2PO4·3H2O,0.25 g MgSO4,0.15 g Fe2(SO4)3,加蒸馏水定容到1 000 mL,将pH值调至6.

筛选平板培养基:28 g果胶,20 g (NH4)2SO4,3.8 g K2HPO4,0.2 g KH2PO4·3H2O,0.18 g CaCl2,0.25 g MgSO4,0.15 g Fe2(SO4)3,20 g琼脂条,0.2 g溴酚蓝,加蒸馏水定容到1 000 mL,将pH值调至6.

斜面培养基:PDA培养基.

1.1.5种子液制备挑单菌落接在PDA斜面上,于30 ℃培养7 d,用无菌生理盐水冲洗斜面,装入含有玻璃珠的锥形瓶中,振荡.用血球计数板计数,调节孢子浓度为2×107个/mL,作为种子液.

1.2培养条件和酶活效价测定方法

1.2.1摇瓶培养及其酶活效价测定摇瓶培养:250 mL三角瓶中装液23 mL,接种2 mL种子液;转速200 r/min,振幅25 mm;温度30 ℃,培养58 h.以下如无专门说明,均与此相同.

在其他条件一定的情况下,单位酶活力与反应后显色物浓度呈线性相关,显色物浓度又与D值呈线性相关.因此可以直接用D值代表酶活力效价,用来反映单位酶活力.

摇瓶培养酶活力效价测定:培养结束后,取发酵液,用离心机离心,上清液即为粗酶液.

试管中加入0.9 mL含1%果胶的缓冲溶液,40 ℃水浴保温3 min;加入0.1 mL适度稀释的粗酶液,反应10 min;加入 3 mL 3,5-二硝基水杨酸(DNS)溶液,混匀,沸水浴3 min;冷却,定容到15 mL.以煮沸灭活酶液作为空白对照调零.适度稀释反应液(使D值保持在0.1~1.0之间),装入1 cm石英皿中,用紫外分光光度计测定540 nm处D540 nm.以加煮沸灭活酶液的试管为空白对照.每次测定3个平行.相关计算公式:

摇瓶培养酶活力效价(U/mL)等于D540 nm×反应液稀释倍数×酶液稀释倍数.

1.2.2深孔培养及其酶活效价测定深孔培养:在适当单孔装液量、振幅、转速下,培养温度为30 ℃,培养时间为58 h.以下如无特别说明,均与此相同.

深孔培养酶活力效价测定.培养结束后,在各孔取 0.1 mL 发酵液,转入空白深孔板对应孔中,用无菌水补足至1 mL,混匀,孔板离心机离心,孔中上清液即为粗酶液.

为方便比较起见,其他测定条件完全同本节.不同的是先在试管中进行DNS反应,适度稀释反应液后,再将反应液移至48孔孔板对应孔中,利用酶标仪快速测定D540 nm.原因是直接利用孔板进行显色反应,沸水浴容易使孔板受热变形,且DNS反应液呈碱性,具有一定的腐蚀性,且稀释样液不方便,都会影响到测定.以加煮沸灭活酶液并经扫板检测的深孔为空白对照.每次测定3个平行,相关公式:

孔板培养酶活力效价(U/mL)等于D540 nm×反应液稀释倍数×酶液稀释倍数.

1.3复合诱变条件的确认

超声波可产生空化作用,使液体中小气泡产生高温高气压,冲击细胞,破坏壁膜,促使胞内外物质交换,从而引发突变.在紫外线照射下,嘌呤、嘧啶会形成嘧啶二聚体,阻碍碱基配对,引发突变.2种诱变方式操作简便,安全无毒,设备易得,突变率高,适合作为诱变因子.而复合诱变具备有效克服疲劳效应、提高突变率的优势.因此本研究决定采用紫外线-超声波复合诱变的方式选育高产菌种.

在平皿中分别装入10 mL种子液,超声波功率480 W,频率40 Hz,分别作用10、20、30、40、50、60、70 min(每个梯度3个平行),计算各梯度致死率.

平皿中分别装入10 mL种子液.将紫外灯功率调至 15 W,距离30 cm,电磁搅拌.分别照射15、30、45、60、75、90、105 s(每梯度3个平行).计算各梯度致死率.致死率用平板计数法计算,3个平行,相关公式为:

致死率等于(1-诱变处理后单位活菌数/未诱变处理时单位活菌数)×100%.

1.4高通量法筛选和分离纯化单菌株

按适当方法进行诱变,将诱变后菌液尽可能全部、分别接入装有培养基的深孔板,每孔接50 μL,共得195孔.振荡培养.

对照出发菌株深孔培养的酶活效价用酶标仪测量,得到高产孔.高产孔中混有高产单菌株的概率明显较高,起到富集高产株的作用;并且,诱变后的菌液几乎全部转接至各孔,用于筛选,大大减少了遗漏可能.

将高产孔中菌液接种于斜面,培养6 d,用无菌水冲洗制成孢子悬液,适当稀释后涂布于筛选平板.挑取菌落较大、水解圈/菌落直径比值较高的单菌落,用灭菌牙签分别挑入48孔板振荡培养.用酶标仪检测酶活力效价,将高产株转接至斜面并编号保藏;同时,将高活力菌株转接入摇瓶中发酵验证酶活力效价.

2结果与分析

2.1深孔板培养方法的优化

2.1.1转速、振幅对酶产量的影响设置转速梯度 40 r/min,振幅梯度10 mm,深孔板装液量1 mL/孔.在深孔中接入出发菌株种子液,按“1.2”节中的方法培养,研究转速、振幅对酶产量的影响.

由图1可以看出:当振幅小于 35 mm 时,产物积累量随转速的提高增长十分有限,可能是深孔中、摇瓶中液体的力学状况明显不同,深孔中的液体相对摇瓶会产生明显的表面张力,培养液所受离心力需要克服表面张力,振荡效果较差,影响了溶氧效果[6];当振幅达到45 mm时,转速从240 r/min增长到280 r/min时,产物积累量有了显著提高,可能是在振幅、转速明显提高后,克服了表面张力,改善了供氧条件.

而在45 mm振幅下,转速超过280 r/min后,进一步提高转速,产物积累量没有明显提高,过高的转速还容易使发酵液溢出,增加了交叉污染的可能.因此,选取深孔培养的振动条件为转速280 r/min,振幅45 mm.

2.1.2单孔装液量对酶产量的影响采用0.2 mL/孔的装液梯度(每个梯度3个平行),转速、振幅同“2.1.1”节中的优化结果,验证装液量的影响.

产酶是一个需氧过程,装液量的多少对果胶酶积累量的影响很大[7].由图2可见:装液量为1.0 mL/孔时,单位效价最高;装液量为1.2、1.4 mL/孔时有所下降,但下降不多,且相互间差别不大;装液量继续加大后,效价有较为明显的下降.

装液量过多会使菌体生长困难,单位产物积累下降,且容易造成交叉污染和空气中的杂菌污染.而装液量过少,会给取样分析造成困难,且容易提高培养液挥发率,影响测定精度.深孔板振荡培养结果表明,四周培养基澄清无生长迹象,因此设置装液量为1.2 mL/孔.

2.2深孔板法用于菌种选育的可行性分析

2.2.1酶标仪替代紫外分光光度计的可行性取14株产酶能力明显不同的突变株,按“1.2.1”节中的方法摇瓶培养后,分别利用酶标仪检测深孔、紫外分光光度计检测石英皿中液体吸光度,得到2组酶活效价.

由图3可见,2组数据排序一致.用SPSS软件分析得到2组数据的相关性,F值等于596.122,P值等于0.000<0.01.

2种测定方法所得酶活效价不同,但2组数据线性回归关系极显著,说明用酶标仪检测法代替紫外分光光度计检测法是可行的.

2.2.2深孔板培养与摇瓶培养产酶量相关性分析由于摇瓶培养、深孔板中的菌体生存环境存在一定区别,会对菌体的生长繁殖和新陈代谢过程产生影响,进而影响产物积累.本研究旨在用深孔培养替代摇瓶培养以提高选育效率,考察同一菌株在2个不同培养环境下彼此之间产物积累量的相关性,有一定的必要性.

取14株产酶能力有明显差异的突变株,分别接入孔板和摇瓶当中培养(做3个平行),按“1.2”节中方法测出2组酶活效价.由图4可见:产量排序大致相同,有2株不同,原因可能是同一菌株对不同生长环境的适应能力不同.用SPSS软件分析2组数据关系可知:F值等于61.533,P值等于0.000<0.01.

2种培养方法之间酶活效价线性回归关系极显著,说明用微孔板培养替代摇瓶发酵,用于快速挑选高产菌株是可行的.深孔产量偏低,可能是深孔供氧能力较差所致.

2.3高通量选育

2.3.1复合诱变条件的确认如图5、图6所示,随着超声波时间的延长,致死率呈线性提高,30 min时达到62.3%,40 min 达到74.6%,50 min时即达到89.3%,70 min开始达到100%.随着紫外照射时间延长,致死率同样迅速提高,45 s 后即达55.6%,60 s时达到71.8%,75 s时达到86.5%,105 s开始达到100%.

致死率过低,会使突变率不足,不利于得到突变菌株.致死率过高,同样不利于得到突变株[8-9].并且,考虑到要先后进行2次诱变,2种诱变条件均不宜处理过长时间,使致死率过高.因此,选取2个诱变因子的致死率均为70%~80%的时间作为处理时间.以此确认诱变条件:超声波处理40 min,紫外照射时间60 s.

2.3.2复合诱变和高通量筛选结果按“2.3.1”节中确认的诱变条件进行复合诱变,再按“1.4”节中的方法筛选高产孔,分离纯化单菌株.

诱变后分接培养的195孔菌中,158孔无生长迹象,其余37孔经酶活检测,结果见图7.可以看出:多孔正变株酶活力得以提高,其中C23孔最高,酶活效价可达254.6 U/mL.对照组(出发菌株)酶活效价:孔板186.7 U/mL.可见高产孔C23比对照(出发菌株)高36.19%.

按“1.2.2”节中方法分离纯化C23孔中菌株,共得到单菌落67株,挑选出17株水解圈/菌落直径比较大、生长比较迅速的单菌株,经摇瓶培养验证,共得到4株高产菌株,分别为:C23-4(687.5 U/mL)、C23-7(701.3 U/mL)、C23-9(692.3 U/mL)、C23-14(698.7 U/mL)(图8).

2.4高产株遗传稳定性验证

将斜面转接分离纯化所得4株高产菌传代培养,每转接1次记为1代.取不同代数菌株进行摇瓶试验,测定酶活效价.由表1可见,C23-7、C23-9这2株菌产酶性能遗传性比较稳定,酶活效价均值分别可达705.7、695.0 U/mL,与出发菌株的477.3 U/mL相比分别提高了47.85%、45.61%,适合作为生产用菌种;而C23-4、C23-14随传代培养而酶活效价下降,可能是因为传代过程中相关性状丢失或者发生了自然分化,不适合作为生产用菌种.

3结论

试验结果表明,本研究尝试建立的采用深孔板微量培育、

表1高产突变株的遗传稳定性

代次酶活力(U/mL)

C23-4C23-7C23-9C23-14

效价与亲本相差效价与亲本相差效价与亲本相差效价与亲本相差

1667.619.9709.88.5689.72.6652.546.2

3618.169.4705.64.3699.57.2649.848.9

5592.994.6699.61.7697.14.8665.733.0

7601.386.2703.21.9693.20.9609.888.9

9587.2100.3710.59.2695.53.2612.985.8

酶标仪快速检测、高通量选育果胶酶高产菌的方法是可行的.与传统选育方法相比,本方法几乎覆盖了诱变后等待初筛的菌,大大减少了高产株遗漏的可能性.最多可一次性利用酶标仪精确测定48个待测样本的酶活力效价,单批次检测量大增,显著提高了初次筛选的效率,大大降低了材耗和能耗,节省了人工,提高了效率.

本方法是一种具备一定应用价值的果胶酶高产菌株选育方法,一些其他产酶菌株,如果所产酶可用紫外分光光度法原理测定(如产纤维素酶菌),亦可尝试利用本方法进行菌种选育.

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