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一种微子L板法检测食品中添加维生素B12含量的方法
维生素B12（VB12）,又称钴胺素（Cobalamin）,是人体中非常重要的水溶性维生素之一,主要用于婴幼儿奶粉、谷物食品、保健食品、乳品和功能性饮料等食品中营养强化.目前针对食品中B12检测方法,国标有GB 5009.217《保健食品中维生素B12测定》、GB 5413.14《婴幼儿食品和乳品中维生素B12测定》,但由于食品成分复杂、存在多种干扰因素,因此化学分析法的应用受到限制,目前国际仍以微生物法作为首选方法.
虽然微生物法检测VB12具有较高的灵敏度和精确度,但GB5413.14方法,步骤繁琐、操作耗时、检测周期长、易受外部因素干扰等诸多问题.本文采用德国拜发公司微孔板法对婴幼儿配方奶粉、谷物米粉、含乳饮料、功能饮料等食品中添加VB12含量的测定,实验稳定性非常好.
材料与方法
材料与仪器：VitaFast Vitamin B12试剂盒（德国拜发P1002）、微量移液器20-200μl;100-1000μl（eppendorf）、50ml离心管,2.0 ml EP管、一次性无菌注射器（带0.2μm无菌滤膜）（Axygen）；生物安全柜（赛默飞世尔1374）、酶标仪（BioTek Instruments ELX808）、恒温培养箱（精宏GNP-9270）、电热恒温水浴锅（精宏DK-8D）
实验方法.
（1）样品处理：称取1g（ml）样品（精确至0.001g）,加40 ml的无菌蒸馏水溶解,放于50 ml带盖离心管中,于95℃水浴锅保温30min,期间至少摇晃4-5次.迅速放于4℃冰箱冷却至30℃以下,用无菌注射器吸取样品过滤0.45μm滤膜,取所需样品于2 ml离心管,稀释至所需倍数.
（2）制备标准溶液：表1为标准溶液的稀释梯度.按照说明书向B12标准品干粉的小瓶内加入适量无菌水,混匀.按表1顺序加无菌水、标准品和测定用培养基于2ml EP管,一式3份.测定培养基按照说明书加10ml无菌水,摇匀,95℃水浴5 min,期间振荡至少5次,迅速放于4℃冰箱冷却至30℃以下,用0.45um滤膜过滤待用.
（3）样品检测：取出所需微孔板条固定于板上,先加150ul培养基至各微孔中,然后依次加150 ul的标准品和样品至各微孔中,一式三份.用粘合箔盖住板条和微孔,用手将粘合箔平压,使其充分封闭微孔板条.
（4）培养：37℃黑暗条件下培育44h-48h.
（5）测定：将微孔板倒置桌面上,振荡,使微生物溶解于培养基中.然后将微孔板翻回前置于桌面上,从对角线方向轻扯下粘合箔,务必另一只手按压放置在桌面上的微孔板,以防止粘合过紧撕扯带起微孔板.用酶标仪630nm条件下读取数值.
结果与分析
绘制标准曲线：以维生素B12含量为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线.如图1,试剂盒标准曲线在0.03-0.18ug/100g范围内线性均良好,相关系数为1,检测限可达到0.03ug/100g
重复性：选取配方乳粉（2份）、配方米粉、含乳饮料、功能饮料为试验样品,每个样品作6次平行试验,测试结果见表2,5种样品6次平行测试的RSD在3.9%-6.9%之间,说明重复性良好.
加标回收率：选择已知维生素B12含量的标准品加入同一乳粉中,加标量分别为250.0ng,150.0ng,100.0ng,进行3次重复试验,结果如表3,回收率为94.2%-100.8%,试验灵敏度较高.
小结与讨论
应用微生物法检测维生素B12,其准确度与灵敏度取决于试验中乳杆菌数量、活力、培养基、样品处理方式以及人员操作等因素.商品化试剂盒通过一定工艺水平将菌株固定在微孔板上,减少菌株活力、培养基等造成的误差,但操作中仍需要注意,1.标准曲线的绘制直接影响实验结果,因为微生物生长是非线性的,随着VB12浓度增加,吸光度的增长渐缓慢；2.使用Ridawin数据处理软件,采用多项式曲线拟合法绘制标准曲线更符合菌株的实际生长情况；3.需无菌操作,移液器头、离心管、过滤膜等需提前灭菌,以避免外来微生物的污染.本文采用微孔板法测试5种食品添加的VB12,定量限在0.03-0.18ug/100g（ml）范围内线性良好,相关系数为1,重复性试验中,样品的平行性较好,相对标准偏差在3.9%-6.9%,加标回收率在94.2%-100.8%,相对繁琐的国标方法,微孔板法是一种操作简单、快捷、准确度和重复性良好,适合各实验室推广应用.
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