毕业论文网
本论文是一篇免费优秀的关于遗传论文范文资料，可用于相关论文写作参考。
日本猪冠状病毒的遗传特征与致病性
一、介绍
冠状病毒亚科的冠状病毒传统上分为3 个属,即α 冠状病毒,β冠状病毒和γ 冠状病毒.最近增加了另一种新型属,δ 冠状病毒.在不同的宿主物种中发现了这类病毒,包括一些哺乳动物和鸟类物种.此后,2014 年在美国俄亥俄州首次发现PDCoV/SDCV,并在美国的其他州也发现了这种病毒.最近在韩国,中国,泰国和老挝等亚洲国家也有发现PDCoVs.PDCoV 是一种有囊膜的正向单链RNA 病毒.
据日本农业部报道,2013 年10月-2015 年9 月,日本已发生1 000多起PED 疫情, 几乎遍布所有地区.然而, 自2014 年以来, 研究人员对几个猪场的腹泻粪便样本进行检测,发现样品中猪流行性腹泻病毒（PEDV）,传染性胃肠炎病毒（TGEV）,其他肠道病毒（轮状病毒和肠道病毒）呈阴性.之前有研究报道称,在PEDV 流行的美国一些地区,患猪的粪便样本中可同时检出PDCoV.此外,已经有三个研究小组证明PDCoV 在实验感染的猪中具有致病性.因此,这些发现表明PDCoV 是除PEDV 之外,在日本的多个猪场引起腹泻暴发的主要病原体之一.
本文中研究人员对2013 年至2014 年间来自腹泻猪的大量粪便样本的PDCoV 进行了特定PCR 检测,以确认PDCoV 在日本的流行.此外,研究人员使用新一代测序技术确定了7 个日本PDCoV 毒株的完整基因组序列,并使用这些序列通过比较和遗传进化分析来表明日本PDCoV 毒株与其他国家公布的PDCoV 毒株之间的遗传关系.此外,研究人员对YMG/JPN/2014 的日本PDCoV 毒株接种剖宫产初乳剥夺的仔猪进行了致病性研究.
二、 材料和方法
1.PDCoV 的样品采集.样品来自在2013 年11 月—2014 年8 月期间,日本全国17 个地区的多个养猪场发生腹泻仔猪或猪.研究人员对477 份粪便样品进行了PDCoV 的特异性PCR 检测, 样品中的PEDV,TGEV 和其它肠道病毒（轮状病毒和肠道病毒）特异性PCR 检测结果呈阴性.将粪便样品制备成在磷酸盐缓冲盐水中稀释的10％悬浮液,4℃,3 000 g 离心10 min.使用QIAamp病毒RNA 提取试剂盒提取病毒RNA.通过实时荧光定量PCR（RTPCR）来检测粪便样品中的病毒.
2. 全基因组测序和进化分析.使用PrimeScript High FidelityRT-PCR 试剂盒,用随机6 聚体引物从72 个PDCoV 特异性PCR 阳性样品中合成DNA（cDNA）.从cDNA 中产生几乎完整的基因组,其由8 个重叠的扩增子组成（约4 kb长）.将8 个扩增子以等量合并,并使用新一代测序技术进行分析.
3. 病毒分离.将猪睾丸（ST）细胞维持在补充有10 ％ 胎牛血清（FBS）的生长培养基中.将6 孔板中每孔ST 细胞接种200 μl 10％肠内悬浮液,这些悬浮液含有5 μg/ml 胰蛋白酶而不含FBS 的生长培养基稀释.在37℃和5％ CO2 培养箱中培养1 h 后移除接种物,并用不含FBS 的生长培养基洗涤细胞3 次,并对每孔细胞加入3 ml 胰蛋白酶培养基.直到观察到以圆形细胞为特征的细胞病变效应（CPE）,以5 d 的间隔在ST 细胞中传代分离的病毒.用胰蛋白酶培养基连续稀释该病毒原液10 倍,并以每孔100μl 接种于96 孔板中生长的ST 细胞中,每次稀释8 个孔.该平板在37℃,5％ CO2下孵育7 d.每日监测病毒CPE,根据Reed 和Muench 描述的方法测定病毒滴度,并表示为TCID50/ml.
4. 动物实验设计.从两种特定的无特定病原体母猪中获得了初乳缺乏的新生仔猪,它们对传染原非常敏感.将11 只小猪（3 日龄）随机分成两组：接种日本PDCoV 分离株,YMG/JPN/2014 的组1 和组2（阴性对照组）.第1 组的个体口服接种2×106 TCID50/ 头的病毒量.从接种后0 d（DPI）至8 d（DPI）每天收集每只小猪的粪便样品,然后第8 DPI 后每3 ～ 4 d 收集每只小猪的粪便样品.从0 DPI 至8 DPI 每隔2d 从每只小猪采集血清样品,在8DPI 之后每3 ～ 4 d 采集血清样品.分别在4 和7 DPI 从组1 中随机挑3 只和组2 中挑1 只仔猪处安乐死进行病理学检查. 监测每组剩余的仔猪的临床表现和病毒排放直至27DPI.为了检查病毒分布情况,从接种PDCoV 和对照的小猪中采集小肠和大肠及其他器官.
根据上述方法从动物收集的10％粪便悬浮液,血清和10％组织匀浆中提取病毒RNA.通过RTPCR确定粪便,血清和各种组织中的病毒含量.
5.PDCoV 特异性兔抗血清的制备.研究人员从美国国家兽医服务实验室获得美国PDCoV 分离株,Michigan/8977/2014 株, 以产生PDCoV 的兔抗血清.
通过间接免疫荧光测定法（IFA）, 研究人员使用FITC 标记的山羊抗兔IgG 抗体评估其针对PDCoV 的兔抗血清在接种美国PDCoV 分离株的ST 细胞上的特异性.此外,通过IFA 评估与PDCoV特异性兔抗血清的交叉反应,但是抗血清不与PEDV 和TGEV 反应.
通过IFA 评估与PDCoV 特异性兔抗血清的交叉反应,但抗血清不与PEDV 和TGEV 反应.
6. 免疫组织化学（I HC）.在4DPI,7DPI 和27 DPI 下接种PDCoV的和对照小猪的小肠和大肠以及其他器官用10％浸泡,石蜡包埋,切片,并安装在载玻片上.用PDCoV 特异性兔抗血清作为第一抗体用二氨基联苯胺作为第二标记抗体对组织进行染色.
三、结果
1. 日本PDCoV 流行概况.在使用477 个粪便样品的PDCoV 调查中,根据PDCoV 特异性实时RTPCR,72 个样品（15.1％）呈阳性.表1 总结了各年龄组PDCoV 阳性样本的检出率.根据PDCoV 的特异性PCR,母猪中几乎有一半（48.3％）为阳性.育肥猪（120 日龄以上）和断奶仔猪（21 ～ 60 日龄）分别以10.5％和10.3％显示次高的阳性率.另外,研究人员的调查显示自2014 年2 月以来,PDCoV 在日本一直存在.2. 全基因组测序和进化分析.使用新一代测序技术分析7 个日本PDCoV 毒株的完整基因组.表2总结了7 种日本PDCoV 毒株的信息.基于完整基因组的进化分析表明,2014 年在日本检测到的7 种PDCoV 毒株与从2013 年到2016 年在美国和韩国的检测的PDCoV 毒株相关,来自日本和其他国家的PDCoV毒株的基因组比较分析显示,日本PDCoV 毒株的完整基因组与美国和韩国PDCoV 毒株几乎完全相同（99.7％～100％同一性）,这些毒株与包括香港PDCoV 毒株的中国PDCoV毒株和泰国,越南和老挝PDCoV 毒株相比具有相当的差异（表3）.
3. 病毒分离.分离的病毒在ST细胞中有效地繁殖3 代.通过RTPCR和免疫荧光测定, 将分离株YMG / JPN / 2014 评估为PDCoV.该分离株在ST 细胞中另外繁殖4次,当用于实验研究时其滴度为106TCID50/ml.
4. 临床症状和排毒.接种PDCoV 的新生仔猪在2 ～ 11 DPI期间出现急性水样腹泻,厌食,毛发枯燥和严重的虚脱, 然后在整个观察期间全部恢复并存活.在PDCoV 接种的小猪的粪便和血清样品中检测到的PDCoV RNA 显示在图2 中.用日本PDCoV 分离株接种
通过使用RT-PCR, 在4 和7DPI 检查PDCoV 接种组的各种组织中的病毒分布（ 图3）.在接种PDCoV 的组中, 病毒主要在从近空肠到直肠的肠组织中检测到,并且在4 DPI 时在肠系膜淋巴结中以108 ～ 1010 拷贝/ml 的范围检测到病毒.此外,4 DPI 时,PDCoV 特异性PCR 还检测到来自肝脏,2/3的胃,十二指肠样品和1/3 肌肉样品的超过107 的病毒RNA 拷贝.在7DPI 时,病毒主要分布在大肠.此外,从肠系膜淋巴结和2/3 远端空肠和回肠样本中检测到超过107 个病毒基因组拷贝.根据PDCoV 特异性PCR,阴性对照组中的所有仔猪,血清和组织样品均为阴性.
5. 免疫组织化学.在4DPI 尸检时使用PDCoV 特异性兔抗血清（表5）,IHC 染色检测来自PDCoV接种组的样品中从近端空肠至结肠的绒毛细胞质和隐窝肠上皮细胞PDCoV 抗原.PDCoV 接种仔猪的平均IHC 评分在空肠近端和盲肠至结肠低,中肠空肠至回肠高,十二指肠和直肠阴性.在7 DPI,病毒主要分布在大肠,从盲肠到结肠病毒含量低.在27 DPI 时,在PDCoV接种组的任何组织中未鉴定到阳性染色.在阴性对照小猪的所有检查组织中未检测到IHC 染色.
四、 讨论
研究人员的调查显示,在2013年-2014 年,在日本几个县的腹泻猪中获得477 个PEDV,TGEV 和其他肠道病毒阴性粪便样品中,有72个样品（15.1 ％）PDCoV 呈阳性.PDCoV 阳性样本的检出率与2014年1 ～ 2 月在美国收集的猪样本调查中观察到的相似（22％）.因为研究人员没有收集腹泻样本的猪群的详细信息,他们的数据不能否认这些腹泻可能是由其他病原体（细菌和寄生虫）引起的可能性,但是表明PDCoV 会与这些腹泻相关.此外,他们的数据还表明,PDCoV 可以感染所有年龄组,类似于PEDV.特别是,研究者的调查显示了带PDCoV的母猪为最高的阳性检测率.事实上,美国首次发现PDCoV 的报道显示,美国的PDCoVs 是在患有水样腹泻的母猪检测到的.在临床观察中,母猪不仅表现出严重的腹泻,还表现出呕吐和厌食.这些发现表明,老年猪对PDCoV 可能比仔猪更敏感.然而,其假设将需要在未来进行进一步验证.
利用基因组序列构建进化树表明,日本检测到的7 种PDCoV 毒株与在2013—2016 年来自美国和韩国的毒株相似.日本收集的PDCoV 毒株与2004—2016 年在其他国家收集的PDCoV 毒株的基因组比较分析显示,来自日本的PDCoV 毒株的完整基因组几乎与来自美国和韩国的完全基因组相同（99.7 ～100％）.因此,自2014 年以来在日本出现的PDCoV毒株与自2013 年以来在美国和韩国出现的那些毒株在遗传上有关.此外,2014 年以来发生在日本的PDCoV 暴发可能是由于来自其他大型猪业的PDCoV 毒株入侵日本而造成的.
为了测试YMG/JPN/2014 毒株的致病性,使用剖宫产初乳剥夺的新生仔猪进行实验性感染.在临床观察中,感染该毒株后少数仔猪中出现轻度腹泻,无呕吐和厌食,但感染后的仔猪在5 d 后从腹泻中恢复.相比之下,用日本PDCoV 分离株接种的仔猪在2 DPI 时患有严重腹泻,但是在11 DPI 时全部从腹泻中恢复,并且存活直至27 DPI.因此,PDCoV 分离毒以及野毒使仔猪产生了腹泻.然而,研究中仔猪腹泻的严重程度和持续时间的差异可能是由不同的条件引起的,如接种量或宿主的易感性.
总之, 研究人员首先发现自2014 年2 月以来PDCoV 已在日本出现.他们的分析表明,自2013 年底以来,PDCoV 可能是导致日本猪群腹泻的暴发的病原体.由于该研究中检测到的PDCoVs 与2013 年以来在其他猪生产国家（如美国和韩国）出现的毒株有关,它们可能代表海外入侵,如PEDV 入侵日本.
遗传论文范文结:
适合遗传论文写作的大学硕士及相关本科毕业论文，相关遗传开题报告范文和学术职称论文参考文献下载。
1、遗传杂志