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血清反复冻融对猪蓝耳病抗体效价的影响
血清反复冻融对猪蓝耳病抗体效价的影响
吴 蔚 福建省南平市动物疫病预防控制中心 福建南平 353000
摘 要 在基层兽医试验中,由于各种原因,主要是时间及条件的限制,往往会遇到血清需要反复冻融的情况.本文基于基层兽医试验的需要,研究血清反复冻融对猪蓝耳病抗体效价的影响.试验发现：经过0~6次反复冻融的血清的抗体效价并无显著差异.在-20 ℃冷冻保存的情况下,即使存放时间达到3个月,血清的抗体效价仍能保持较高水平.
关键词 血清 反复冻融 猪蓝耳病 影响
文献标识码：A
文章编号：1003-4331（2018）02-0018-03
The effect of serum repeated freeze-thaw on antibody titer of PRRS
Wu Wei
(Nanping Center for Animal Disease Control and Prevention, Nanping Fujian 353000)
Abstract In the practice of the grass-roots veterinary,often, the serum needs to be repeatedly frozen for some reasons.We research the effect of serum repeated freeze-thaw on antibody titer of PRRS is based on need to grassroots veterinarian. The data shown that there was no significant difference in the antibody titer of serum after 0~6 cycles of freeze-thaw. In the case of cryopreservation at -20 ℃, even if the storage time is 3 months, serum antibody titer still can maintain a higher level.
Key words Serum Repeated freezing and thawing PRRS Influence
猪繁殖与呼吸障碍综合征（猪蓝耳病）,是以母猪繁殖障碍和仔猪严重的呼吸道症状及高死亡率为特征的猪病毒性传染病.是我国法定的二类动物疫病[1].无论是高致病性猪蓝耳病还是经典猪蓝耳病,目前,我国普遍采用疫苗免疫的手段[2-3].因此,做好免疫后的血清学抗体监测就显得十分必要.然而在基层兽医试验中,主要是时间及条件的限制,往往会遇到血清需要反复冻融的情况.本文基于基层兽医试验的需要,研究血清反复冻融对猪蓝耳病抗体效价的影响.
1 材料与方法
1.1 样本与试剂 待检测猪蓝耳病抗体的血清、猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒（法国LSI）.
1.2 主要仪器设备 冰箱（4 ℃）及冰柜（-20 ℃）、酶标仪、微量移液器、恒温生化培养箱、纯水仪.
1.3 试验方法
1.3.1 待检血清的筛查 将刚采集的猪全血析出血清,使用间接ELISA法对猪血清进行初筛,选取其中不同抗体水平的22份阳性血清（经病原学检测为猪蓝耳病病毒荧光RT-PCR阴性）进行试验,并记录下初筛时22份阳性血清的IRPC值.
1.3.2 试验血清的反复冻融 将由1.3.1初步筛查选出的22份不同抗体水平的阳性血清样品编号后（1至22号）进行分装,每一份血清分装成6份,分别进行1次、2次、3次、4次、5次冻融以及不冻融操作,具体方法为：（以样本1为例）将样本1用离心管分装成6份,每份样本100 μL.第1份标记1-1,第2份标记1-2,以此类推,标记至1-5,未冻融处理的样本标记1-0,然后将这6份样本全部放入冰柜（-20 ℃）保存1 d.第2 d取出样本1-5,放至室温,待离心管内血清全部融解后再放入冰柜（-20 ℃）保存.第3 d取出样本1-4和1-5,放至室温,待离心管内血清全部融解后再放入冰柜（-20 ℃）保存.第4 d取出样本1-3、1-4和1-5,放至室温,待离心管内血清全部融解后再放入冰柜（-20 ℃）保存.第5 d取出样本1-2、1-3、1-4和1-5,放至室温,待离心管内血清全部融解后再放入冰柜（-20 ℃）保存.第6 d取出样本1-1、1-2、1-3、1-4和1-5,放至室温,待离心管内血清全部融解后再放入冰柜（-20 ℃）保存.至此,完成样本1的反复冻融.样本2至样本22,参照样本1的冻融方法进行.所有样本均同步进行反复冻融.冻融次数相同的样本合装1小袋,每袋
22个样本,共6小袋.并在袋上用记号笔做好标记.完成样本的反复冻融后,所有样本均放置冰柜
（-20 ℃）保存3个月.由于最后所有样本均放置冰柜（-20 ℃）保存3个月,也算是反复冻融,故所有样本在之前反复冻融次数上增加1次.22份样本的冻融次数均为冻融1次、2次、3次、4次、5次及6次.
1.3.3 反复冻融后样本的抗体检测 采用猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒进行反复冻融6次的22份样本进行间接ELISA法检测.检测其OD450 nm值.最终将其换算为IRPC值.
1.3.4 方差分析 对以上样本试验后的IRPC值用软件SPSS 17.0进行方差分析.
2 试验结果
2.1 样本初筛时IRPC值 试验所选取的22份样本初筛时其IRPC值均＞20,为猪蓝耳病抗体阳性,并呈现不同抗体水平,有弱阳性及强阳性之分,见 表1.
2.2
不同冻融次数测得的22份样本IRPC值 不同冻融次数所测得的22份样本IRPC值见表2.经不同冻融次数以及较长时间冷冻（-20 ℃,3个月）,22份样本的IRPC值均＞20,说明该批样本仍能测出抗体阳性,并且如初测时一样呈现不同抗体水平.
2.3 方差分析结果 用软件SPSS 17.0对表1-表2数据进行方差分析,得到方差分析统计结果,见表3.F等于0.782,P（sig）等于0.585＞0.05,无显著差异.
表3 IRPC值方差分析结果
3 分析与讨论
该试验是结合南平市春季动物防疫集中监测时进行的,所选取的样本为在不同规模场不同抗体水平的猪血清.在研究不同冻融次数对抗体水平的影响时,同步做了对应猪鼻腔拭子（22个样本）的荧光RT-PCR试验,检测结果均为阴性.试验均由同一人在同一环境下操作,并且在酶标板上分布血清样本时,遵循同一个样本分布在同一块酶标板上的原则,这样做能尽量避免出现需要板间校正的情况.
试验时特别选取无溶血的22个血清样本.但是在动物疫病防控日常监测中,样本从养殖场（户）到实验室的各个环节,出现溶血样本是比较常见的（尤其是禽血清）.由于条件所限,该试验无法研究溶血等因素对血清抗体效价的影响,待试验条件成熟后再进一步研究.但大量研究资料表明,溶血对检测结果有影响[4].如隆维东等[5]对30例标本分别在溶血前及溶血后采用全自动血细胞分析仪进行血常规检测,对比溶血前后血常规14项检测指标的差异发现,溶血标本对血常规多个项目均有干扰.表1和表2的试验结果说明,经过3个月的低温（-20 ℃）冻存后,血清样本在保存完好的情况下,仍能在血清中测出抗体,而且大部分抗体仍旧保持较高的效价.
试验结果说明,经过反复冻融的血清样本,其IPRC值并无统计学差异.即经过1次、2次、 3次、4次、5次和6次反复冻融对血清样本的抗体效价并无太大影响.这与钟锦辉等[6]研究血清冻融次数对猪瘟抗体效价影响的结果大体一致.试验中只研究不超过6次反复冻融对猪蓝耳病抗体效价的影响,是基于基层兽医实验室在日常监测中的实际操作,而人医资料表明,多次反复冻融对血清中某些指标有较大影响[7].因此,建议在检测抗体实际操作中,血清标本如需保存多次使用,还是少量分装冻存为宜.
参考文献：
[1] 田克恭.高致病性猪蓝耳病流行现状与免疫防控进展[J].中国猪业,2010(6)：9-11.
[2] 刘训山.经典猪蓝耳病与高致病性猪蓝耳病的临床区别及防控措施[J].现代农业科技,2011(5)：334-338.
[3] 李园园.高致病性猪蓝耳病的发病特征及综合防控措施[J].河南畜牧兽医,2011,32(11)：28-29.
[4] 汪建国.溶血、脂浊标本对ELISA法检测HBsAg结果的影响[J].现代实用医学,2009,21(8)：818-819.
[5] 隆维东,刘万彬,李坚.标本溶血对血常规检测结果的影响分析[J].国际检验医学杂志,2012,33(9)：1127-1129.
[6] 钟锦辉,张海明,段晓冬,等.血清冻融次数对猪瘟抗体效价的影响[J].广东畜牧兽医科技,2013,38(1)：17-19.
[7] 傅慧平,刘文俊.血清冷冻保存对生化检测结果的稳定性研究[J].中国临床研究,2009(1)：1.
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