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樟芝适宜的液体发酵培养基配方
王丽星,黄志伟,郑亚凤,等. 樟芝适宜的液体发酵培养基配方研究［J］. 江苏农业科学,2016,44（7）：236-239.
doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.07.066
樟芝适宜的液体发酵培养基配方研究
王丽星1, 黄志伟1, 郑亚凤1, 谢宝贵2
（1.福建农林大学食品科学学院,福建福州 350002； 2.福建农林大学菌物研究中心,福建福州 350002）
摘 要：研究了珍贵药用菌——樟芝(Antrodia camphorata)液体发酵适宜的碳源、氮源、碳氮比及其所需的矿质元素、微量元素、维生素.结果表明：樟芝菌丝生长的最适无机氮源为酒石酸铵；最适有机氮源为麸皮；最适天然碳源为米粉,且以天然多糖类物质(木薯粉除外)为碳源处理的菌丝产量明显高于单糖、双糖、化学制剂多糖处理,而葡萄糖是仅次于天然多糖类物质的碳源；菌丝生长适宜的碳氮比为(20~50) ∶1；K、P、Mg、S、Na、Ca均为菌丝生长必需的矿质元素；微量元素Fe、B、Zn、Mn、Mo、Cu、Co均对樟芝菌丝生长有一定抑制作用,其中Fe、B元素的抑制作用最显著；添加维生素对菌丝生长无显著影响.
关键词：樟芝；菌丝体；液体发酵；培养基配方
中图分类号： S188+.4文献标志码： A
文章编号：1002-1302(2016)07-0236-03
收稿日期：2015-09-17
基金项目：福建省科技计划重点项目(编号：2015N0001).
作者简介：王丽星(1992—),女,福建仙游人,硕士研究生,研究方向为食品生物技术.E-mail：982842976@.com.
通信作者：谢宝贵,教授,博士生导师,研究方向为食用菌及生物技术.E-mail：mrctatu@163.com.
樟芝(Antrodia camphorata)属于多孔菌科、薄孔菌属［1］,别称牛樟菇、牛樟芝、樟内菇、红樟菰等,为中国台湾特有的珍贵药用真菌［2］.樟芝仅寄生在台湾特有树种牛樟(Cinnamomum comphora)的树干上［3］,具有抗肿瘤、增加免疫力、抗菌、抗病毒、抗过敏、抗高血压、降血糖、降胆固醇、抑制血小板凝集及保护肝脏等生理功能［4］.
目前野生樟芝数量很少,而且尚未能进行其子实体的人工栽培,所以采用液体发酵培养樟芝的菌丝体是最环保的樟芝获取途径,并且菌丝体的效果接近子实体［5］.刘华等研究了樟芝液体发酵培养条件,采用的培养基配方为40 g/L葡萄糖、6 g/L豆饼粉、1 g/L K2HPO4、100 mg/L 维生素B1,pH值自然,接种量为20%,装液量为100 mL/250 mL三角瓶,转速100 r/min,26 ℃恒温培养6 d后,胞内的三萜产量达 152.5 mg/L［6］.黄大斌等在电子显微镜下观察了樟芝的菌丝体、子实体、分生孢子,并在琼脂培养基上研究了不同碳源、氮源对樟芝菌丝生长的影响,结果发现樟芝菌丝生长最适温度为28 ℃,木屑培养基的最适含水量为58.5%,最适碳源为2%葡萄糖,最适氮源为0.2%柠檬酸铵［7］.黄志伟等对樟芝菌丝体的固体培养特性进行了研究,结果表明以杂木屑、麦皮(或稻草粉)为主料的培养基均可培养出生长良好的樟芝菌丝,菌丝生长适宜的PDA 培养基pH 值为4~8,在木屑培养基中添加3%~5%的过磷酸钙可促进菌丝生长,光照和黑暗条件下菌丝的生长速度没有显著差异,但在黑暗条件下菌丝长势较好,分生孢子较多［8］.宋爱荣对樟芝液体培养的碳源、氮源分别进行了研究,结果表明碳源以麦芽糖利用效果最佳,有机氮比无机氮的利用效果更好,其中以酵母膏最佳［9-10］.陈娟等以樟芝菌丝生物量、三萜、多糖为响应指标,利用Plackett-Burman法筛选樟芝液态发酵培养基碳源、氮源,结果显示,最有利于提高樟芝菌丝生物量的碳源、氮源为葡萄糖、可溶性淀粉、酵母粉,最有利于提高樟芝多糖含量的碳源、氮源为可溶性淀粉、麸皮,而最有利于提高樟芝三萜含量的碳源为麦芽糖［11］.凌庆枝等研究表明,樟芝对不同无机盐离子需求不同,对钾盐需求量大,对钠盐、铁盐、镁盐、铜盐需求量少［12］.本研究探讨了适宜樟芝液体发酵的碳源、氮源、碳氮比及其所需的矿质元素和微量元素等,以期为深入研究樟芝的液体发酵工程技术奠定基础.
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试菌株樟芝菌株Ac-A,由福建农林大学菌物研究中心提供.
1.1.2供试培养基配方
1.1.2.1研究不同氮源对樟芝菌丝生长影响的培养基配方基础培养基配方：3%葡萄糖、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O、5 mg/L 维生素B1,pH值自然.添加的无机氮种类为硫酸铵、氯化铵、磷酸氢二铵、酒石酸铵、硝酸钾、硝酸钠、硝酸钙、；有机氮种类为蛋白胨、大豆粉、麸皮、玉米粉.氮源添加量为0.032 g N/100 mL无机氮、0.2%蛋白胨、5%天然有机氮.
1.1.2.2研究不同碳源对樟芝菌丝生长影响的培养基配方基础培养基配方：0.032%(以氮含量计算)酒石酸铵、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O、5 mg/L维生素B1、pH值自然.添加的碳源种类为葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、可溶性淀粉、微晶纤维素、玉米粉、面粉、米粉、甘薯粉、木薯粉.碳源添加量为2%.
1.1.2.3研究不同碳氮比对樟芝菌丝生长影响的培养基配方基础培养基配方：2%葡萄糖、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O、5 mg/L 维生素B1,pH值自然.分别在基础培养基中添加不同质量的酒石酸铵以调节培养基的C/N.
1.1.2.4研究不同矿质元素对樟芝菌丝生长影响的培养基配方基础培养基配方：2%葡萄糖、0.211%酒石酸铵、5 mg/L 维生素B1,pH值自然.按表1在基础培养基中添加各种试剂,配制出6种缺素培养基和1种对照培养基.
1.1.2.5研究不同微量元素对樟芝菌丝生长影响的培养基配方基础培养基配方：2%葡萄糖、0.211%酒石酸铵、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O,pH值自然,用重蒸馏水配制1 L基础培养基后,加入15 g CaCO3,在121 ℃下灭菌20 min,冷却后过滤除去微量元素,随后加入5 mg 维生素B1,并按表2添加各种微量元素.
1.1.2.6研究不同维生素对樟芝菌丝生长影响的培养基配方基础培养基配方：2%葡萄糖、0.211%酒石酸铵、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O,pH值自然.添加的维生素种类为生物素、核黄素、硫胺素、尼古丁酸、叶酸、抗坏血酸,对照不添加任何维生素.维生素添加量为50 μg/L.
1.2方法
1.2.1不同氮源对樟芝菌丝生长的影响将培养基分装于250 mL三角瓶中(100 mL/瓶),每个处理4瓶,在121 ℃下灭菌30 min.接种时,先将樟芝斜面菌种放入盛有无菌水的三角瓶中,用分散器搅拌匀浆,使之成为均匀的菌液.然后用移液吸取菌液接种于各瓶培养基中(1 mL菌液/100 mL),接种后置于摇床上振荡培养(26 ℃、120 r/min )20 d.用纱布和40目土样筛过滤樟芝菌丝,分别盛入已于105 ℃下烘至恒质量的坩埚,再将坩埚置于105 ℃烘箱中烘至恒质量后,测定菌丝干质量.然后用SAS 软件 对数据进行方差分析与显著性测验.
1.2.2不同碳源、矿质元素、微量元素、维生素对樟芝菌丝生长的影响参照“1.2.1”节的方法进行培养基的分装、灭菌、接种、培养、测定菌丝干质量等.
1.2.3不同碳氮比对樟芝菌丝生长的影响设置8个C/N,即 5 ∶1、10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、50 ∶1、75 ∶1、100 ∶1,在基础培养基中添加酒石酸铵调节培养基的C/N,酒石酸铵添加量依次为16.03、6.35、3.96、2.88、1.86、1.09、0.72、0.54 g/L.然后参照“1.2.1”节的方法进行培养基的分装、灭菌、接种、培养、测定菌丝干质量等.
2结果与分析
2.1不同氮源对樟芝菌丝生长的影响
2.1.1无机氮对樟芝菌丝生长的影响由图1可见,不同氮源处理下菌丝产量差异较大,说明樟芝对氮源种类的要求较为严格.不同氮源处理下樟芝菌丝产量高低排序为蛋白胨(有机氮)>铵态氮>硝态氮,差异明显.以硝酸钾、硝酸钠、硝酸钙为氮源时,菌丝产量与对照无明显差异,说明樟芝不能利用硝态氮.既可以提供硝态氮,也可提供铵态氮,其菌丝产量比硝态氮高,但比铵态氮低,说明NO-3可能抑制樟芝菌丝生长.樟芝菌丝生长最适宜的无机氮源为酒石酸铵.
2.1.2有机氮对樟芝菌丝生长的影响由图2可见,不同有机氮源处理下樟芝菌丝产量高低顺序为麸皮>大豆粉>玉米粉>蛋白胨>无氮对照,差异明显.以麦皮为氮源时,其菌丝产量是蛋白胨处理的5倍,是最适于樟芝菌丝生长的氮源.
2.2不同碳源对樟芝菌丝生长的影响
从图3可以看出,以天然多糖类物质为碳源处理的菌丝产量明显高于双糖、单糖.以米粉为碳源处理的菌丝产量最大,与其他碳源处理差异明显.本研究使用了5种天然物质和2种化学制剂多糖,除木薯粉外,以天然物质为碳源处理的菌丝产量明显高于以化学制剂多糖(可溶性淀粉、微晶纤维素)为碳源的处理.将天然物质作为碳源,水解后可提供多
种糖类供菌丝吸收利用,并且它还含有少量氮素营养或一些生长促进因子,可促进菌丝生长.以麦芽糖、蔗糖为碳源处理的菌丝产量较低.葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露醇中,唯有葡萄糖适于樟芝菌丝生长.
2.3不同碳氮比对樟芝菌丝生长的影响
基于上述碳源、氮源的筛选结果,选用适于樟芝菌丝生长的碳源(葡萄糖)和无机氮源(酒石酸铵)来调节培养基的 C/N,以研究适宜樟芝菌丝生长的C/N.从图4可以看出,在所研究的C/N范围内,C/N为10 ∶1以上时均适于樟芝菌丝生长,在C/N为(20~50) ∶1时菌丝生长最快.
2.4不同矿质元素对樟芝菌丝生长的影响
从图5可以看出,矿质元素K、P、Mg、S、Na、Ca的缺乏均会明显影响樟芝菌丝的生长,即这6种元素均为菌丝生长必需的矿质元素.其中,缺Na、缺Ca对菌丝产量影响较小,而K、P、Mg、S的缺乏将极大程度地影响菌丝生长.
2.5不同微量元素对樟芝菌丝生长的影响
从图6可以看出,7种微量元素(Fe、B、Zn、Mn、Mo、Cu、
Co)均对樟芝菌丝生长有一定的抑制作用,其中Fe、B元素对樟芝菌丝生长的抑制作用最为明显.
2.6不同维生素对樟芝菌丝生长的影响
从图7可以看出,所添加的6种维生素均对樟芝菌丝的生长没有明显影响.
3结论与讨论
本研究分析了樟芝液体发酵适宜的碳源、氮源、碳氮比及其所需的矿质元素和微量元素等,结果表明樟芝菌丝生长的最适无机氮源为酒石酸铵,最适有机氮源为麸皮；最适天然碳源为米粉,且以天然多糖类物质(木薯粉除外)为碳源处理的菌丝产量明显高于单糖、双糖、化学制剂多糖处理；菌丝生长适宜的碳氮比为(20~50) ∶1；K、P、Mg、S、Na、Ca均为菌丝生长必需的矿质元素；微量元素Fe、B、Zn、Mn、Mo、Cu、Co均对樟芝菌丝生长有一定的抑制作用,其中Fe、B元素的抑制作用最显著；添加维生素对菌丝生长无明显影响.
本研究中以蛋白胨为氮源处理的菌丝产量明显高于无机
氮源处理.而黄大斌等研究发现,在琼脂培养基上以蛋白胨、酵母汁为氮源处理的菌丝生长速度不如柠檬酸铵、、硫酸铵等无机氮源处理［7］.因此,如果用琼脂培养基活化樟芝菌种,应采用无机氮源；如果进行樟芝菌丝体的液体发酵生产,则应采用有机氮源.
本研究表明,以葡萄糖为碳源处理的樟芝菌丝产量明显高于麦芽糖、半乳糖处理,且葡萄糖是仅次于天然多糖类物质的碳源.而黄大斌等研究表明,在琼脂培养基上,以葡萄糖为碳源处理的菌丝生长速度快于山梨醇糖、半乳糖、麦芽糖、淀粉处理［7］.因此,以葡萄糖作为碳源,不但适于樟芝菌种的活化,而且适于樟芝菌丝体的液体发酵生产.
本研究还表明,在樟芝的液体发酵培养基中不需要添加维生素.因此,可以推测在樟芝菌丝生长过程中,菌丝体会合成自身生长所需维生素.
参考文献：
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