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白芨多糖提取的工艺优化
摘 要：以白芨为材料,通过单因素试验和正交试验法,采用水提醇沉法提取白芨多糖,苯酚硫酸法测定多糖含量,对白芨中的主效成分白芨多糖提取工艺进行了探究.结果表明：单因素最佳试验条件为料液比1∶15,提取温度60 ℃,提取时间1.5 h,醇沉浓度85%；正交试验最佳条件为料液比1:20,提取温度70 ℃,提取时间1.5 h；经验证试验得出白芨多糖更适宜的提取工艺条件为料液比1:20,提取温度70 ℃,提取时间1 h,利用优化的水提醇沉法工艺提取白芨多糖含量可达75.22%.
关键词：白芨多糖；水提醇沉；正交试验
中图分类号：S68
文献标识码：A
文章编号：1674-0033（2018）04-0049-05
Extraction Conditions Optimization of Polysaccharide from Bletilla striata
LIU Chang-ming, WANG Jie
(School of Biopharmaceutical Engineering and Food Engineering, Shangluo University, Shangluo 726000, Shaanxi）
Abstract:To explore the best extraction process of polysaccharide from Bletilla striata, the single factor experiment and orthogonal array design, as well as the water extraction and alcohol precipitation, phenol-sulfuric acid methods were used for polysaccharide extraction and polysaccharide content determination respectively. Results indicated that the optimal extraction processes in single-factor experiment （g:mL）were 1:15 ratio of solid-liquid, adding 85% ethanol, extracting at 70℃ with 60 min each time. The optimal extraction processes in orthogonal array design （g:mL）were 1:20 ratio of solid-liquid, extracting at 70℃ with 1.5 hour each time. Furthermore, more appropriate extraction processes validated were 1:20 ratio of solid-liquid, extracting at 70 ℃ with 60 min finally, and the max content of polysaccharide reached to 75.224% under the optimal parameters.
Key word:Bletilla striata polysaccharide; water extraction and alcohol precipitation;orthogonal array design
白芨［Bletilla striata(Thunb.)Reichb. f.］又名白给、连及草等,产地主要在我国广西、贵州、云南、四川、陕西南部等[1].白芨是兰科白芨属的药用植物,对细菌和其他病原菌微生物均有抑菌和杀菌作用[2].干燥的白芨块茎味苦甘涩,性平微寒,归肺、胃、肝经,其功效主要有补肺、消肿、收敛止血、散结逐腐、生肌敛疮等,被称为“外科最善”[3].研究表明,白芨乙醇浸提液可抑制枯草杆菌、金葡萄球菌、变形球菌、大肠杆菌及人型结核杆菌[4].目前,在临床医学上,白芨块茎的药用成分较多,但主要为白芨多糖（Bletilla striata polysaccharide,BSP）,又称白芨胶[5].据相关文献表明,国内研究白芨药用成分主要集中在中医中药的传统经验阶段,而对其不同方法提取时最优提取工艺条件及抗菌活性研究较少,对抗菌消炎、促进伤口愈合、生物安全性等机制方面的研究亟待深入[6-7].白芨多糖在医学研究上有诸多的应用,不仅具有抑菌作用,还是一种优良的天然生物黏附材料,在作为药物载体等方面有其独特作用,然而对其最优提取工艺条件研究还较少[8-9].本研究通过水提醇沉法对商洛白芨的多糖提取工艺进行优化,筛选最优的提取工艺条件,并比较云南、贵州与商洛栽培白芨中的白芨多糖含量,为当地白芨资源的进一步开发利用及栽培引种提供借鉴作用.
1 材料与方法
1.1 材料
商洛白芨［Bletilla striata(Thunb.)Reichb. f.］采自商洛市丹凤县两年生栽培,云南、贵州白芨分别为云南文山和贵州赤水的两年生栽培.
1.2 方法
1.2.1材料的准备
将新鲜的白芨块茎流水下洗净,切片后置于恒温干燥箱中,42 ℃烘48 h至无水分即可.将干燥后的白芨块茎经小型粉碎机粉碎后,过80 mm的药典筛,得白芨粉末.
1.2.2白芨多糖提取预试验
准确称取白芨粉末3 g置于锥形瓶中,加入60 mL的蒸馏水,在80 ℃水浴锅中温育2 h,四层纱布过滤,将滤液收集.滤渣继续加水提取2次,将3次提取的滤液合并后,进行旋转蒸发浓缩,至原体积的1/3.向浓缩后的滤液中加入Sevager试剂（氯仿：正丁醇等于5:1）,滤液与Sevager试剂的体积之比为5:1,充分震荡摇匀,3500 r·min－1离心10 min,取上清液,加入三倍体积的95%乙醇进行沉淀,充分搅拌后,密封,室温下静置一夜,抽滤后真空冷冻干燥,得白芨粗多糖.称重后保存于－20 ℃冰箱待测.
1.2.3白芨多糖提取单因素试验
以料液比（材料质量g/所用溶剂的体积mL）、提取温度(℃)、提取时间(h)、醇沉浓度(%)为四因素设置四水平的单因素试验,如表1所示,其余步骤同方法1.2.2,提取得到白芨粗多糖.
1.2.4白芨多糖提取正交试验
以单因素试验结果为基础,筛选出单因素中的料液比、提取温度、提取时间、醇沉浓度各因素中白芨多糖含量最多的一个水平值,上下取值,其余按1.2.2的步骤进行,得白芨粗多糖.由于在单因素试验中,醇沉浓度为85%时获得的白芨多糖含量最高,故综合考虑后选择对白芨多糖含量影响相近的料液比、提取温度、提取时间三个因素进行正交试验,正交试验因素水平,见表2.
1.2.5标准曲线的制作
准确称取D-葡萄糖对照品,配置成2.5 g·L－1标准溶液,现用现配[10].分别量取葡萄糖标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL于试管中,对应加入0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 mL蒸馏水,再各加1 mL的5%苯酚溶液、5 mL的浓硫酸,震荡摇匀后,静置30 min.以蒸馏水做对照,在490 nm波长下测OD值.以葡萄糖标准溶液浓度（X,μg·mL－1）为横坐标,以OD值(Y)为纵坐标,得出线性方程与相关系数分别为Y等于0.009 8X+0.026 8,R2等于0.996 5,表明线性关系良好.
1.2.6白芨多糖含量的测定
参照雷于国等[11]的方法,将干燥的白芨多糖粉碎后,精密称取0.01g,加入适量蒸馏水在磁力搅拌器60 ℃下充分溶解后,定容至100 mL,配成样品溶液.吸取1 mL样品溶液于试管中,加入1 mL的5%苯酚溶液,5 mL浓硫酸,震荡摇匀,静置30 min,在490 nm波长下测OD值.将OD值代入回归方程,得其浓度,白芨多糖含量计算公式为：
白芨多糖含量W（%）等于(样品浓度C×样品定容后的体积V/样品的质量m)×100
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1料液比对白芨多糖含量的影响
取4个锥形瓶,各加入5 g白芨粉末,再分别加入75、100、125、150 mL蒸馏水,80 ℃提取2 h后重复提取两次,三次重复.其余操作同方法1.2.2,结果见表3.
由表3可知,随着料液比的增加,多糖含量逐渐降低,料液比1:15与其他组达显著性差异水平.虽然料液比为1：30时多糖含量较料液比为1：25有显著升高,但仍显著低于料液比为1：15的含量,且其提取得率也低.综合考虑后续浓缩、醇沉等工艺,取料液比1:15为最佳条件.
2.1.2温度对白芨多糖含量的影响
取4个锥形瓶,各加入5 g白芨粉末和100 mL蒸馏水,分别在60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃下提取2 h,重复提取两次,三次重复.其他操作同方法1.2.2,结果见表4.
由表4可知,随着温度的提高,多糖含量不断降低,提取温度60 ℃时获得的白芨多糖在同因素中最多,与提取温度80 ℃和90 ℃呈显著性差异,且其得率也最高.因而,白芨多糖的最佳提取温度选择60 ℃.
2.1.3提取时间对白芨多糖含量的影响
取4个锥形瓶,各加入5 g白芨粉末和100 mL蒸馏水,80 ℃下分别提取1.5、2、2.5、3 h,重复提取两次,设三次重复.其他操作同方法1.2.2,结果见表5.
由表5可知,随着提取时间的延长,白芨多糖含量呈降低趋势,提取1.5 h与3 h的多糖含量达显著性差异水平,得率也最高,而与2 h和2.5 h差异不显著.分析其原因可能是由于随着提取时间的增加,致使较多杂质成分的溶出.因而,综合考虑确定1.5 h为最佳提取时间.
2.1.4醇沉浓度对白芨多糖含量的影响
取4个锥形瓶,各加入5 g白芨粉末和100 mL蒸馏水,80 ℃下加热2 h,重复提取两次,合并提取液,浓缩至原体积的1/3,除去杂蛋白后,分别用65%、75%、85%、95%乙醇沉淀过夜,三次重复.其他操作同方法1.2.2,结果见表6.
由表6可知,不同的醇沉浓度对白芨多糖含量影响较大,以85%的醇浓度沉淀所获得的多糖含量最高,显著高于其他各组.而其得率又低于其他醇浓度,尤其是显著低于95%醇浓度的多糖得率.综合考虑,确定醇沉淀浓度为85%.
在进行白芨多糖单因素提取的过程中,主要考虑白芨多糖的含量,而白芨多糖的得率在工业生产方面也是需要考虑的重要方面.因而本研究的单因素采用了以多糖含量为主,提取得率为辅的方法进行白芨多糖含量的最佳提取条件优选.单因素试验确定的白芨多糖提取最优条件为：料液比为1:15,提取温度60 ℃,提取时间1.5 h,醇沉浓度为85%.
2.2 正交试验优化提取工艺
2.2.1白芨多糖提取的正交试验结果
以影响白芨多糖含量相近的3个因素即料液比（g:mL）、提取温度（℃）、提取时间（h）为优选因素,每个因素下设定三个水平进行正交试验,结果见表7.
通过表7直观分析表明,各因素对白芨多糖含量的影响大小为B>A>C,即提取温度>料液比>提取时间.从试验数据上得出理论上最佳提取条件为A3B3C1,即料液比1:20,提取温度70 ℃,提取时间1 h.但通过L9（33）正交试验结果（表8）及相关资料表明,在9组试验中的第9组,白芨多糖的提取条件为A3B3C2,即料液比为1:20,提取温度为70 ℃,提取时间为1.5 h为正交试验中的最佳提取条件.
2.2.2验证试验
为进一步确定更适宜的白芨多糖提取工艺条件,将理论上最佳提取工艺与正交试验中最佳工艺进行对比验证.
通过表9可以直观看出,理论上最佳提取工艺的白芨多糖得率和含量均比正交试验中最佳提取工艺的要高,多糖得率高出了5.133%,多糖含量高出6.734%.因而,经过验证试验得出白芨多糖提取最佳工艺条件为A3B3C1,即料液比1:20,提取温度70 ℃,提取时间1 h.
表9 理论与正交试验最佳白芨多糖提取工艺的验证结果
2.3 不同产地白芨多糖含量比较
分别称取来自陕西商洛、云南文山和贵州赤水的白芨材料粉末3 g,按料液比1:20加入60 mL蒸馏水,70 ℃下加热提取1 h,过四层纱布得滤液,再重复提取两次,合并滤液,浓缩,除蛋白,85%乙醇醇沉过夜,其余操作同方法1.2.2,比较结果见图1.
由图1可知,利用优化的工艺条件所提取的白芨多糖在云南文山白芨中含量最高,达75.22%,其次是陕西商洛白芨,为57.98%,贵州赤水白芨的含量最低,为54.92%.三个地区的白芨多糖得率相差均不超过1%,表明该优化工艺条件适宜于白芨多糖的提取.
3 讨论与结论
张雪娇等[12]利用加热煮沸回流法提取白芨胶中糖含量达75.1%,本研究通过单因素和正交试验方法确定的白芨多糖提取的最优工艺条件得到的结果与其类似,即料液比1:20,提取温度70 ℃,提取时间1 h,白芨多糖含量可达75.22%.而赵会然等[13]对云南部分兰科植物多糖提取工艺研究认为,以40倍水70 ℃加热提取2 h后,加适量95%乙醇在4 ℃下醇沉12 h为兰科植物多糖的最佳工艺条件,并且重复性好.常影等[14]认为粗叶悬钩子根多糖提利用水提醇沉法以温度90 ℃,时间2 h,料液比1:15效果最好.本研究利用不同醇浓度沉淀时发现,95%醇溶液可获得较高的多糖得率,但多糖含量却显著低于85%的醇浓度,分析可能是由于醇沉的时间及温度所导致,或是不同白芨多糖在不同的醇沉浓度下分离出来的分子量不同而异[15-16].
本研究所得的最佳工艺条件为料液比1:15,提取温度70 ℃,提取时间1 h,这与赵会然等[13]对云南部分兰科植物多糖提取的研究结果相似,因提取温度在几个因素中影响最大,而这两个研究结果均为70 ℃；本研究而与赵宁等[3]对白芨多糖以料液比1:10在90 ℃提取1.5 h的结论不同,原因是在多糖的提取过程中,实验材料的来源、醇沉时的浓度以及实验前的处理不同,也将影响其研究结果.
在白芨多糖提取过程中,提取方法较多,但各有利弊.韩欣等[17]对白芨多糖提取方法讨论中提到溶剂提取法不需特殊设备、成本低,是最常用方法.赵会然等[13]在白芨多糖提取方法认为采用超声波辅助提取时,多糖得率与热水提取相当,纯度也相近,加大超声功率有助于多糖释放溶出,但因超声波对多糖链存在一定破坏,故还原糖含量也随之升高；醇水提取虽成本较水提高,但因在提取前将醇溶性杂质除去,有效提高多糖纯度,减少后期纯化步骤.因而本研究采用了水提醇沉法提取白芨多糖,不仅提取率较高,也较方便,成本也较低.
同时,本研究通过比较不同产地栽培白芨的多糖含量发现,云南文山的白芨多糖含量最高,达75.22%,商洛白芨的多糖含量低于云南白芨,为57.98%,贵州白芨的多糖含量最低,为54.92%.而刘长命等[18]利用超声波辅助提取法对三个不同产地的野生白芨多糖含量研究表明,商洛野生白芨的多糖含量最高,达78.87%,表明商洛地区的野生白芨具有较高的开发利用价值,但在引种栽培方法方面还有待于提高.
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（责任编辑：李堆淑）
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