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双水相萃取法提取紫花油豆中凝集素
摘 要：本文建立了一种从紫花油豆中快速高效分离凝集素的方法,采用PEG-盐双水相体系进行分离,以上相蛋白得率和纯化倍数作为评价指标,分别考察了(NH4) 2S04质量分数、PEG600质量分数和体系pH值三种显著单因素,同时用SDS-PAGE电泳对其进行检测,探究凝集素在PEG600/(NH4)2S04双水相体系中的分配规律.结果表明：双水相体系分离凝集素的最优条件为(体系共5mL)：3mL25% (w/w)的(NH4) 2S04溶液、ImL 90% (w/w)的PEG600溶液、ImL的粗蛋白提取液、调pH值为7.5,此时上相蛋白得率为42.32%,纯化倍数为3.08.
关键词：紫花油豆：凝集素：双水相萃取
由于能够特异性结合单糖、多糖和糖蛋白,植物凝集素在医学、材料科学和农学方面发挥了巨大的作用和价值Ⅲ.紫花油豆（菜豆）是我国东北地区分布的一种地方性物种.其中蛋白质含量达20%以上.这些蛋白质其合理的氨基酸组成和较高的凝集素含量,使其具有较高的营养价值和生物学价值.
作为传统的蛋白质分离方法,硫酸铵沉淀法也用于提取凝集素.此方法的缺点是它耗时长且产量低.亲和层析法大大提高了凝集素的产量,但其工业化成本高且难以扩大生产.因此,建立一种快速、经济高效的凝集素提取方法,以提高选择性和产量,降低成本尤为重要.
目前,双水相提取技术也被尝试用于分离纯化凝集素.2010年,Nasa -mento研究了Canaliabrasiliensis凝集素(ConBr)在PEG600/磷酸盐体系以及PEG600/柠檬酸钠体系中的分配.Soares研究了在PEG8000/柠檬酸盐体系中,从CanaliaensUiormis种子的粗提取物中提取和纯化ConcanalinA(ConA)o Nascimento采用PEG8000/柠檬酸钠体系从Cratyliamollis种子中提取凝集素.结果表明,PEG／盐双水相体系在提取凝集素方面具有很大的优势.
本项研究,以PEG600/(NH4)2S04双水相体系作为提取工具,以紫花油豆为原料,建立一种直接从豆类粗提液中提取凝集素的方法.
1材料与方法
1.1材料及试剂
紫花油豆种子,哈尔滨香坊区贡宾种子公司；聚乙二醇600 (PEG600),天津致远化学试剂有限公司；氢氧化钠,天津市耀华化学试剂有限公司；氯化钠（分析纯）,天津市凯通化学试剂有限公司；硫酸铵（分析纯）,上海成捷化学有限公司；福林酚试剂（分析纯）、牛血清白蛋白,北京索莱宝科技有限公司.
1.2仪器与设备
紫外可见分光光度计（型号：T6新世纪）／北京普析通用仪器有限责任公司；电泳试剂盒／北京索莱宝科技有限公司；Mini-PROTEAN电泳仪／Bio-RAD公司.
1.3试验方法
1.3.1凝集素的粗提取
挑选籽粒饱满的紫花油豆种子,用粉碎机粉碎,将充分粉碎后的紫花油豆种子过50目筛,得到的粉状物用1：6 (w/v)石油醚脱脂处理,重复3次后在4℃下使用0.02mol／L磷酸盐溶液浸提12 h,浸提液离心,10 000 rpm离心35min,得到的上清液作为双水相提取的原料,4℃储存.
1.3.2双水相萃取
将90% (w/w) PEG600溶液、25% (w/w) (NH4)2S04溶液、1mL粗提液依次加入lOmL带有刻度的玻璃离心管中,使体系总体积为5mL,再加入NaCl固体,置于涡流混匀器上混匀后,使用NaOH溶液调节体系的pH值,在2000g离心lOmin后完成相分离.测量相体积后,收集上相以测定蛋白质浓度和进行电泳分析.
1.3.3 Folin´s酚法测定凝集素的含量
使用BSA（牛血清白蛋白）作为标准,在650nm读取样品的吸光度.
1.3.4测定血凝活性
在微量滴定板中进行凝血活性(HA)的测定.将凝集素(50μL)用中风生理盐水溶液进行2倍系列稀释,添加50μL的2%兔红细胞悬浮液.当阴性对照完全沉积时,在室温下45 min后读取结果.
1.3.5凝集素特异性活力计算
2双水相单因素试验结果与分析
2.1 (NH4)2S04质量分数对提取效果的影响
不同浓度(NH4)2S04上相纯化倍数和得率,如图l所示.
由图l可知,上相蛋白得率与纯化倍数随着(NH4)2S04质量分数的增加而增加,当(NH4)2S04达到25%时纯化倍数与蛋白得率达到最大值,随着(NH4)2S04继续增加,上相蛋白得率与纯化倍数呈下降趋势.分析其原因为：当(NH4)2S04为15%时,由于体系中离子强度较低两相之间的疏水作用力差异性较小,此时蛋白大部分分配到盐相；随着(NH4)2S04的增加,体系中离子强度增加,疏水作用力增强,蛋白在盐相中的溶解性降低,迫使蛋白由下相向上相移动,所以上相蛋白得率和纯化倍数都逐渐增加,当(NH4)2S04为25%时二者达到最大值.当(NH4)2S04大于25%时,高浓度的盐溶液会破坏蛋白表面水化膜,蛋白溶解度降低,使部分凝集素蛋白沉淀出来,所以上相蛋白得率与纯化倍数降低.
2.2 PEG600质量分数对提取效果的影响
不同浓度PEG600上相纯化倍数与得率,如图2所示.
由图2可知,上相蛋白得率与纯化倍数随PEG600增加而增加,当PEG600为90%时二者达到最大值,之后随着PEG600的继续增加,上相蛋白得率与纯化倍数呈下降趋势.当PEG600为50%时,不能够形成双水相体系；当PEG600为60%时,两相之间疏水作用力差异性较小,PEG600相剥夺水分子能力弱,下相中盐离子浓度较小,下相中盐析作用较小,不能推动蛋白由一相向另一相移动；随着PEG600的增加,PEG600相剥夺水分子能力增强,上相体积增大,下相体积减小,两相之间疏水作用力增大,促使凝集素蛋白由下相向上相移动,使上相蛋白得率与纯化倍数随之增加；当PEG600为100%时,上相中的空间斥力作用加强,体系的黏度增加．下相中的凝集素蛋白分子停留在两相界面处,在两相之间形成一层乳化层,从而阻碍了凝集素蛋白分子在相间的传递和扩散,降低了上相蛋白得率与纯化倍数.
2.3 pH值对提取效果的影响
不同pH值上相纯化倍数与得率,如图3所示.
由图3可知,上相蛋白得率与纯化倍数随pH值增加而上升,在pH为7.5时上线蛋白得率与纯化倍数达到最大,之后随着pH值增大,上线蛋白得率与纯化倍数同时下降.pH值的变化一方面影响盐离子的种类,另一当面改变蛋白质所带电荷的状态,当pH值较低时,体系pH值处在凝集素蛋白的等电点附近,凝集素蛋白聚集在一起,形成沉淀,同时两相之间不能形成跨越界面的电位差,不能促使凝集素蛋白从一相向另一相移动；随着pH值的增加,体系pH值远离蛋白的等电点,两相之间蛋白分配越不均匀越有利于蛋白从一相向另一相移动,当pH值达到7.5时两者达到最大值；随着pH值的继续增大,碱性条件下铵根离子与氢氧根离子结合,释放出氨气,溶液中离子浓度降低,推动蛋白移动的作用力减小,使得上线蛋白得率与纯化倍数下降.
3结论
研究得到PEG600/(NH4)2S04双水相萃取紫花油豆中凝集素的最优条件为(体系共5mL)：3mL的25%(NH4)2S04溶液(W/W),ImL的90%PEG600溶液(W/W),粗提液体积ImL,体系pH值为7.5,此时上相蛋白得率为42.32%,纯化倍数为3.08.
双水相论文范文结:
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