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榄香烯对肺癌A549细胞的增殖抑制作用与其对细胞凋亡的影响
张国民 王 静
（兖矿集团有限公司总医院 山东邹城 273500）
摘 要：目的：探讨榄香烯对肺癌A549细胞的增殖抑制作用及其对细胞凋亡的影响.方法：每批细胞按空白对照组和药物处理组随机分组,检测榄香烯对癌细胞的增殖抑制作用；采用流式细胞光度分析术（FCM）检测细胞凋亡率及细胞周期时相分布,同时进行细胞的形态学观察.结果：榄香烯存在剂量依赖性和时间依赖性,榄香烯在48小时、72小时榄香烯对A549细胞周期有明显影响；榄香烯可阻滞A549细胞于S期并诱导细胞凋亡,但细胞凋亡率并不完全与药物浓度成正相关.结论：榄香烯对肿瘤细胞具有较强的增殖抑制作用,在一定药物浓度范围内,随药物浓度的增加榄香烯可使细胞凋亡率升高,但超过一定作用浓度,药物的细胞毒作用增强,细胞凋亡率则呈下降趋势.
关键词：榄香烯；肺癌A549细胞；增殖抑制作用；细胞凋亡；影响
榄香烯是近年来我国首先从活血化瘀中药温莪术挥中提取的一种抗癌有效成分.药理学试验表明,其抗用疗效确切、毒副作用小、抗瘤谱广,具有广阔的应用前景[1].现已证实诱导肿瘤细胞凋亡是其抗癌作用机制的重要方面之一[2].本实验在以往研究的基础上探讨了榄香烯在不同药浓度时对肺癌A549细胞凋亡的影响,以期为榄香烯临床上能更合理有效地用于肺癌治疗提供一些实验依据.
1材料与方法
1.1材料和试剂
本研究中榄香烯乳注射液由大连金港制药有限公司提供：肺腺癌细胞株A549由重庆医科大学检验系临床生化教研室惠赠；A54培养在加10％胎牛血清（杭州四季青公司）的 RPMI1640培养液（Hydone产品）,内含青、链霉素10万/L,细胞在37 oC 5％C02培养箱培养；MTT为Sigma产品,二甲亚砜为分析纯,重庆东方试剂厂产品.
1.2主要仪器
流式细胞仪（FACScma Becton Dickison美国）,透射电子显微镜（HITACHI-600型 日本）,自动酶标读数仪（Bio-Rad-2500型 美国）
1.3方法
1.3.1榄香烯对肺腺癌细胞生长的抑制作用 噻唑蓝还原法（MTT法）测定,用新鲜培养液配制揽香烯,使其终浓度成为10ug/ml、20ug/ml、40ug/ml、80ug/ml.取对数生长期的细胞、用胰酶消化,台盼蓝计数,用RPMI1640将A549稀释成1×104/ml单细胞悬液,取96孔板三块,每孔加200u1稀释好的细胞,再加20ul已配制不同浓度实验药物．设试剂对照（每孔加1640培养液200u1）和肿瘤细胞 阴性对照,置37oC5％CO2培养箱,每组设8个复孔,培养 24小时,48小时和72小时后,每孔分别加5mg/m1 MTT 20ul,同样条件再保温 4小 时,小心吸取上清液,每孔加200ul DMSO,置于微震荡器上震摇 5分钟混匀．置于酶标仪上,以波长570nm,试剂对照组调零,测光密度值OD.按下式可计算出各浓度组的抑制率.以上实验各重复3次,求平均值.
1.3.2肺癌A549细胞凋亡的形态学观察 在收集A549细胞前,将细胞培养瓶直接放置于倒置显微镜下进行观察；比较不同浓度药物处理组及空白对照组在经过处理后细胞形态、大小及细胞群体生长情况的不同；照相并记录实验结果.
1.4 统计方法
运用SPSS11.5进行统计分析,多组间比较采用方差分析,组间两两比较采用q检验,按α等于0.05为检验水准.
2结果
2.1榄香烯对A549细胞周期的影响
榄香烯存在剂量依赖性和时间依赖性,榄香烯在24小时对A549细胞周期无明显影响,48小时,72小时榄香烯对A549细胞周期有明显影响,剂量上榄香烯80ug/ml比40ug/ml作用更明显,其作用环节主要是影响细胞周期S期向G2、M期的转变过程,将肿瘤细胞阻滞在S期,减少进入G2、M期的细胞数目抑制肿瘤细胞生长代谢,减少其有丝分裂,导致肿瘤细胞数目减少.同时,时间上24小时无明显影响,72小时和48小时对A549细胞周期的影响无明显差异,因此,我们认为榄香烯80 ug/ml作用48小时,抑制A549细胞生长的效果最明显.
2.2榄香烯对A549细胞凋亡的影响
细胞形态学观察结果显示,随药物浓度的增加细胞生长密度逐渐下降,正常的多边形细胞形态中异形细胞逐渐增多.与空白对照组细胞相比,在0.01 mg·mL-1的药物浓度作用下,细胞变化不明显；在0．04 mg·mL-1的药物浓度作用下,则可见体积缩小、胞核固缩的圆形细胞即凋亡细胞明显增多；在0.08 mg·mL-1的药物浓度作用下除了以上明显变化外,尚可见许多散在膨大、染色质疏松的不规则形细胞即坏死细胞,有些甚至已发生胞膜破裂,且细胞生长受抑情况明显可见；在0.10 mg·mL-1的药物浓度作用下,上述表现更加明显；在0.16 mg·mL-1的药物浓度作用下,则可见大量细胞从瓶壁脱落形成细胞碎片,细胞形态大小不一,正常的细胞形态几乎不曾观察到,大多为圆形固缩细胞或不规则形膨大细胞.
3 讨论
诱导肿瘤细胞凋亡是榄香烯抗癌作用机制的重要方面之一,从本实验结果来看,也确实证实了这一点,榄香烯可阻滞肺癌A549细胞从S期进入G2/m期并诱导细胞发生凋亡.另外本实验结果还显示在作用时间一定的情况下,榄香烯对肿瘤细胞的增殖抑制作用虽与药物浓度成正相关,但其诱导肿瘤细胞凋亡的作用并不与药物浓度成简单的直线相关关系.作用时间为24 h时,药物发挥其诱导肿瘤细胞凋亡的最佳浓度应该在0.04～0.08 mg·mL-1,超过此浓度,药物对癌细胞的直接杀伤作用将转为其体外抗癌的主导因素,使细胞坏死增多,而诱导细胞自发性死亡减少[3].
经过对不同实验结果的综合分析,还发现不同种癌细胞对榄香烯的敏感性有显著差异.如杨骅等[4]的实验结果表明,在作用时间为72 h时榄香烯对HL-60白血病细胞的IC50为27.5 mg·mL-1,对K562白血病细胞的IG0为81 mg·mL-1,可阻滞细胞从S期进入G2/m期.徐学军等[5]的研究结果则显示J}榄香烯可阻滞肝癌
MC-7721细胞从Go/G1期进入S期,作用时间为24 h时的IC50,为37.5 mg·mL-1.由此提示,榄香烯的抗瘤谱虽广,但对不同肿瘤细胞存在着明显的药物作用差异性,而且其对细胞凋亡的调控也可能存在着多个调控点.如果要想对此作出合理的解释,就有必要继续深入榄香烯诱导肿瘤细胞凋亡作用机制的研究.这将对榄香烯类药物的开发、应用及对肿瘤治疗新思路的开辟具有深远影响.
参考文献：
[1]宋国强,杨荣强,李杰等.檀香烯乳联台放疗晚期非小细胞肺癌的临床观察. 抗癌,2011（1）：39～4l
[2]曾涌波. 榄香烯乳联合经肝动脉介入化疗治疗原发性肝癌．中国肿瘤临床,2011,28：235～236.
[3]时继慧,李成章,刘德兰,等．温莪术挥发油的实验药理研究榄香烯抗肿瘤作用的研究[J]．中药通报,1981,6（1）：36
[4]杨骅,王仙平,郁琳琳等．榄香烯抗癌作用与诱发肿瘤细胞凋亡[J]． 中华肿瘤杂志,2012,18（3）：169
[5]徐学军,周子成,罗云辉,等．榄香烯诱导人肝癌细胞株MC-7721凋亡的研究I-J]．第三军医大学学报,2013,21（4）：268.
作者简介：张国民,山东菏泽人,专业药学,学历本科,主治医师,研究方向为药物临床应用.
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