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草鱼凝集素分子的基因克隆和进化分析
草鱼是我国重要的养殖淡水鱼,其产量以及产值居于鱼类养殖业的前列.
凝集素是一类具有糖结合专一性,并与之非共价可逆结合的非酶、非免疫来源的蛋白质,其中把活性依赖于Ca2+者称为C型凝集素.C型凝集素都具有一个或多个糖结构识别域（Carbohydrate-recognition domain,CRD）.鱼类中所存在的天然凝集素分子在其非特异性免疫中占据重要地位,是鱼类抵御异己物质入侵的一道防线.
材料与方法
材料.在超市购买健康的草鱼,体长大约为30cm,体重为1.47kg.
方 法 . （ 1 ） 草 鱼 凝 集 素 基 因 的 克隆：从草鱼组织中提取草鱼RNA,并通过RT-PCR技术克隆获得草鱼凝集素基因.采用反转录试剂盒合成cDNA.以草鱼的cDNA为模板,根据已设计好的引物,运用PCR技术获得草鱼凝集素基因.根据草鱼凝集素的保守CRD设计引物,CILECF：
ATGGAAGATATTGAAAATTACACCA,CILECR：GATATCATGTTAAGTGTGTGATAGGATCCATCTC.PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；56℃退火40s；72℃延伸40s；25个循环,72℃延伸10min.最后,通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物.（2）TA克隆：将PCR产物与pEASY-T1Simple vector载体连接.链接产物转化DH5α感受态,挑单克隆进行菌落PCR鉴定.将鉴定的阳性克隆送至南京金斯瑞生物科技有限公司测序.（3）构建进化树：在GenBank中查找不同物种C型凝集素,下载其氨基酸序列.利用ART对各物种凝集素的二级结构中的结构域进行了初步分析.用Clustalx软件对所选物种的凝集素CRD的氨基酸序列进行多重序列比对.再结合分子生物学分析软件MEGA4.0将比对结果以邻接法（NJ法）构建系统进化树.
结果
草鱼凝集素基因克隆结果.实验结果显示在草鱼肝和肠组织中扩增出800bp左右的片段,与预期一致.
草鱼凝集素基因全长序列分析.用生物信息学在线分析软件对草鱼凝集素基因的测序结果进行分析（如图1）,草鱼凝集素基因的开放阅读框的长度为为795bp,编码一个由264个氨基酸残基组成的蛋白质,其蛋白质的相对分子质量为29868.1,等电点为5.03,46~68aa为跨膜区,125~256aa为CRD.氨基酸序列上的第125、136、153、232、247、255位置上含有6个高度保守的半胱氨酸残基（三角内）,并且该凝集素只有一个CRD（下划线部分）.氨基酸序列还含有一个结合甘露糖的糖识别结合位点即EPN基序（椭圆内）和一个作为C型凝集素重要标志的WIGL序列（矩形内）.
草鱼凝集素的系统进化分析.用生物信息学MEGA4.0以邻接法（NJ法）构建草鱼,斑马鱼,鲫鱼,雀鳝,原鸡,家鼠,牛,人等C型凝集素蛋白的系统进化树.从图2可以看出系统进化树分为三大支,草鱼同斑马鱼,鲫鱼,雀鳝,白斑狗鱼,虹鳟,大西洋鲑进化关系较近,处于一支,说明C型凝集素在进化过程中,草鱼同硬骨鱼的亲缘关系较近,其中与斑马鱼的关系最近.
草 鱼 凝 集 素 基 因 的 同 源 性 分 析 . 用DNAMAN对所选物种凝集素的CRD进行多序列比对发现,草鱼凝集素CRD与斑马鱼凝集素CRD的相似度达到90%,同鲫鱼、雀鳝、大西洋鲑和虹鳟的相似度分别达到83%、63%、53%和51%.序列比对结果进一步验证了在草鱼的CRD中存在6个保守的半胱氨酸（用箭头标出）残基和一个甘露糖结合位点EPN基序（用棱形标出）,并且在这几种硬骨鱼凝集素的CRD中均存在WIGL序列.
由此可以看出,草鱼凝集素的CRD与斑马鱼的同源性最高.
讨论
本 研 究 用 T r i z ol法从草鱼组织中提取RNA,通过RT-PCR技术克隆获得草鱼凝集素基因的开放阅读框的长度为795bp,编码了一个由264个氨基酸残基组成的蛋白质.生物信息学软件分析发现,用ART对该蛋白质的结构进行分析,发现草鱼凝集素蛋白是由一个跨膜区（46~68aa）和一个CRD（125~256aa）组成,且CRD位于该蛋白的C端,含有六个保守的半胱氨酸残基,由此可以判定草鱼凝集素的CRD属于标准长型CRD.从其序列分析来看,在草鱼凝集素的CRD上存在一个WIGL基序和甘露糖结合位点即EPN基序,因此可以确定该凝集素是一种C型凝集素.同源性分析表明,草鱼与斑马鱼的相似度最高,达到90%.从系统进化树分析结果表明草鱼凝集素与斑马鱼的亲缘关系最近.可利用已获得的草鱼凝集素基因作为重组表达的基础,用真核表达系统进行表达纯化,研究其蛋白质的组成及功能,研发出新型的病害治疗药物,应用于草鱼的免疫和病害防御上,实现健康、可持续的养殖.
作者简介：
米亚双（1991-）,女,河南南阳人,河南师范大学在读研究生.
基因克隆论文范文结:
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