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接种球孢白僵菌提高烟草对蚜虫和菌的抗性
摘 要：球孢白僵菌既是一种广泛用于农林及卫生害虫生物防治的昆虫病原真菌,也是多种植物的内生真菌.为探索球孢白僵菌的应用新途径,以烟草为供试植物,研究外源接种球孢白僵菌5株不同菌株对定殖以及植株抗虫抗病的影响.结果表明,不同菌株在烟草中的定殖率存在明显差异,且随着时间的延长,植株中定殖菌株的检出率下降.不同接种方法的定殖效果差异明显,其中叶面喷雾接种的定殖效果优于浸根接种.叶面接种的球孢白僵菌可正常萌发和生长,菌丝定殖于叶面组织内部.叶面接种球孢白僵菌对烟蚜产生明显的趋避性,而且提高了烟草对病菌的抗性.
关键词：球孢白僵菌；烟草；真菌定殖；植物抗虫性；植物抗病性
球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是一种广泛用于农林以及卫生害虫生物防治的昆虫病原真菌[1-2],但作为活体生防真菌制剂,在田间应用过程中易受环境条件的影响,如高温干旱、紫外线辐射直接影响真菌的活力和应用效果[3].探索有效克服环境条件的不利影响或增强生防真菌制剂的环境适应性的途径,对发挥生防真菌应有的潜力具有重要意义.
近年来研究表明,球孢白僵菌是多种植物的内生真菌,如玉米[4]、高粱[5]、马铃薯、棉花、番茄、[6]、曼陀罗、苍耳子和松树[7]等.这些发现为研究球孢白僵菌等生防真菌应用提供了新的思路,即通过外源接种球孢白僵菌定殖植物,增强植物对病虫害的抗性及促进植株生长.如利用浸根(或根状茎)法、注射法或浸种法分别接种球孢白僵菌于香蕉[8]、木薯[9]、番茄、棉花[10]、[11]等,尽管不同接种方法以及不同菌株在同种植物中的定殖效果存在差异,但均可定殖于植物,形成共生关系.其中利用一株球孢白僵菌11-98 分生孢子处理番茄和棉花种子,提高了植株对病原真菌Rhizoctonia solani 和Pythium myriotylum 以及病原细菌Xanthomonasaxonopodis pv. malvacearum ( 棉花病原细菌) 的抗性[10].将分离自瘿蜂（Iraella luteipes）幼虫的一株球孢白僵菌处理(Paper somniferum L.)种子成功内生定殖于植株,保护植株免受瘿蜂的为害[11].由此表明,外源引入球孢白僵菌定殖植物是提高病虫害抗性的一条有效途径,可有效避免直接应用真菌制剂受到田间变化环境条件的影响.
针对特定作物筛选定殖效率高的球孢白僵菌菌株及接种方式是引入定殖的前提.该研究选择5株绿色荧光蛋白（GFP）标记的球孢白僵菌菌株,通过喷雾和浸根方式接种烟草植株,评价不同接种方式及不同菌株在烟草中的定殖效果,并探索定殖球孢白僵菌对烟草抗虫、抗病的影响,以期为烟草病虫害生物控制提供依据.
1 材料与方法
1.1 供试菌种
供试5 株球孢白僵菌亲本菌株Bb0062、Bb02、Bb07、Bb08 和Bb025,分别分离自菜粉蝶（Pierisrapae L.）幼虫（ 重庆）、松毛虫（Dendrolimuspunctatus Walker）（贵阳黔灵山）、桃蚜（Myzuspersicae Sulzer）（重庆）、美洲蜚蠊（Periplanetaamericana）（重庆）和松毛虫（Dendrolimus punctatusWalker）（重庆缙云山）.试验菌株均是通过遗传转化标记GFP 的工程菌株,即将GFP 基因置于真菌组成型启动子PgpdA下转化球孢白僵菌[12].
1.2 供试烟草
试验材料为本氏烟草（Nicotiana benthamiana）,烟草种子在腐殖土中萌发,将发芽初期幼苗移植到小的盆钵中,放置在温室大棚中,定期浇水施肥,培养30 d 左右时间,待烟草长出6～7 片叶后,开始接种球孢白僵菌.
1.3 接种方法
1.3.1 叶面喷雾法每株烟草用一个手握式喷雾器将5 mL 浓度为2×107 conidia/mL 孢子悬浮液喷洒于植株叶片.为了避免孢子落到土壤中,每盆植株的表面覆盖一层塑料薄膜.用0.05%（v/v）Tween-80 处理的植株作为对照.每处理接种30 株植株,设3个重复.
1.3.2 浸根法将5 mL 浓度为2×107 conidia/mL 孢子悬浮液滴至烟草根部土壤.用0.05%（v/v）Tween-80 处理的植株作为对照.每处理30 株植株,设3个重复.
接种后,置于人工气候室（25 ℃）保湿培养24 h后继续培养,光照：黑暗为16 h∶8 h.定期浇水、施肥管理.
1.4 定殖效果检测
1.4.1 组织分离法接种7 d 和30 d 后,利用内生真菌组织分离法分离培养.分别随机选取10 株接种前长出的叶片（叶面接种）或根部（根部接种）,其中根组织用自来水冲洗干净,然后用剪刀将叶片剪成5 mm 见方的小块,根系则剪取5 mm 左右的小段,分别用0.5% Naclo 溶液和70%乙醇进行表面消毒各2 min,再用无菌水冲洗3 次.然后用无菌手术刀将表面消毒的叶片或根组织切成小块,接种到含有200 ug/mL 草胺膦（Bb02、Bb08、Bb0062 和Bb252）或40 ug/mL 氯嘧磺隆和500 ug/mL 头孢青霉素的PDA 平板上,于26 ℃恒温培养7 d,待组织块周围长出菌落后,结合菌落形态、荧光显微镜观察GFP荧光以及PCR扩增GFP片段,验证分离菌株.1.4.2 显微观察法对于组织分离阳性的植株,则选取叶片切块后,用乳酸棉酚兰染色液染色,在倒置显微镜（Olympus公司）下观察菌体在叶面的生长状态.
1.5 抗虫性观察
将喷雾接种7 d 后的烟草叶片置于烟蚜发生苗圃人工气候室培养,观察接种植株烟蚜发生情况.
1.6 抗病性观察
在烟草叶片上喷雾接种球孢白僵菌分生孢子,每隔7 d接种一次,连续接种4次,然后将植株置于烟草病菌（Erysiphe cichoracearum）发生严重的苗圃,观察接种球孢白僵菌的烟草菌的发病情况.
2 结果与分析
2.1 不同菌株在烟草中的定殖效率
通过叶片喷洒和浸根两种方法接种烟草植株,分别于接种7 d 和30 d 后,取样进行组织分离培养.结果发现,接种叶片或根部均可分离到相应抗性的球孢白僵菌（见图1）,经抗性（抗草甘膦或氯嘧磺隆）筛选、GFP 荧光观察和PCR 扩增GFP 验证,表明组织分离菌株为GFP 标记的球孢白僵菌相应菌株.分析发现,5 株菌株均可定殖于烟草叶片和根部,但不同菌株定殖效率存在差异.叶片喷雾接种7 d,Bb0062 和Bb025 的定殖率均达到83% ,而Bb02、Bb07 和Bb08 的定殖率分别为67%、67%和50%（见图2A）.接种30 d 后,尽管各菌株组织检测定殖的球孢白僵菌效率均下降,但Bb0062 和Bb025的定殖率均高于其他3株菌株.根部接种后菌株的定殖效率也出现相似的趋势（见图2B）.
2.2 不同方式接种球孢白僵菌影响定殖效率
不同方法接种球孢白僵菌,定殖效率存在明显差异.叶面喷雾接种7 d 和30 d 后,5 株菌株在叶片的定殖率分别在50% ～83% 和23% ～37%,而浸根接种7 d 和30 d 后,5 株菌株在叶片的定殖率分别在7% ～37% 和7% ～23%（见图2）.由此表明,叶面喷雾接种的定殖效率显著高于浸根接种.
A：叶面喷雾接种不同菌株后7 d和30 d的球孢白僵菌定殖率；B：浸根接种不同菌株后7 d 和30 d 的球孢白僵菌定殖率.
2.3 球孢白僵菌在烟草叶片上的萌发生长
为探究叶面喷雾接种后球孢白僵菌的萌发及生长,选择接种5 d 后的叶片,乳酸棉酚兰溶液染色后制片,在倒置显微镜下观察,结果发现,5 株球孢白僵菌在烟草叶片可以正常萌发并生长成菌丝.由于采用表面消毒后组织分离内生菌方法仍可分离出球孢白僵菌,表明菌丝在叶片细胞间隙生长,定殖于叶片组织.
2.4 烟蚜对接种球孢白僵菌的烟草植株具有趋避性
将叶片喷雾接种7 d后的烟草植株置于烟蚜发生苗圃人工气候室培养,结果发现,培养15 d 后对照组所有植株均侵染了烟蚜,而接种5 株球孢白僵菌的植株未发生蚜虫侵染现象.由此表明,接种球孢白僵菌改变了烟蚜对植株的喜好性,蚜虫对接种的烟草具有趋避性.
2.5 接种球孢白僵菌的烟草对病的抗性为探究球孢白僵菌对烟草抗病性的影响,将连续叶面喷雾接种4 次Bb025 和Bb0062 的烟草植株置于病发生严重的苗圃培养.培养30 d 后发现,对照组出现了严重的病症状,而接种了白僵菌的烟草则出现轻微的病感染症状.由此表明,叶面喷雾接种球孢白僵菌可增强烟草植株对菌的抗性.
3 讨论
该试验研究的是利用昆虫来源的球孢白僵菌接种烟草,尽管不同菌株定殖效率存在差异,但均可成功定殖于烟草叶片和根部,表明人工引入定殖白僵菌到特定植物是切实可行的,关键是筛选效率高的菌株.该研究发现,叶片接种球孢白僵菌定殖检出率明显高于根部接种,推测烟草根基复杂的理化特性及微生物生态对球孢白僵菌定殖具有一定影响.
烟草中引入定殖白僵菌引起蚜虫的趋避性,即蚜虫不喜欢接种球孢白僵菌的烟草植株.显微观察发现,叶片接种的球孢白僵菌孢子也萌发成菌丝,在叶片表面和细胞间隙生长.作为一种昆虫病原真菌,球孢白僵菌本身对蚜虫可能具有趋避性.已有研究报道,昆虫病原真菌绿僵菌（Metarhiziumspp.）产生次级代谢产物对昆虫和一些微生物具有毒性[13].白僵菌产生的白僵菌素具有抗细菌、抗肿瘤、抗真菌和杀虫活性[14].因此,不排除定殖于烟草植株的球孢白僵菌产生对烟蚜有毒性的代谢产物,引起蚜虫的趋避反应.另外,球孢白僵菌定殖于烟草叶片,也可能改变叶片营养成分或产生特殊的挥发性物质,对蚜虫具有一定的趋避作用.
已有证据表明,昆虫病原真菌球孢白僵菌、轮枝菌（Verticillium）等对植物病原真菌具有明显的拮抗作用[10, 15].球孢白僵菌拮抗植物病原真菌涉及抗生作用[16-17]、生存竞争[18]以及诱导植物系统性抗性[10, 19]等.该研究结果显示,喷雾接种的球孢白僵菌在烟草植株叶面萌发生长.通过表面消毒后进行组织分离,仍然可以分离到接种的菌株,表明显微观察的菌丝部分已侵入叶面组织内定殖.由此推测,定殖于植株的球孢白僵菌占据了有利的生态位,植株不再容易被菌侵染植株,即生态位竞争优势.另外,定殖的球孢白僵菌可能诱导烟草产生系统新抗性,提高了菌等病原真菌的抗性.定殖的球孢白僵菌也可能产生抗菌代谢产物,如白僵菌素等[14],拮抗菌侵染.
烟草论文范文结:
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