毕业论文网
本文关于标记论文范文,可以做为相关论文参考文献,与写作提纲思路参考。
分子杂交为核心的分子标记技术
摘 要：以分子杂交为核心的分子标记技术是早期分子技术的一个重要方向,全面分析汇总了分子杂交为核心的分子标记技术的种类、机理、特点等,并着重介绍该技术在水稻中的实际应用.
关键词：分子杂交；分子标记；RFLP；小卫星
基于分子杂交为核心的分子标记技术主要包括RFLP标记和小卫星标记,主要原理是利用限制性内切酶酶解不同生物体的DNA分子后,使用同位素或非同位素标记的随机基因组克隆、微卫星等作为探针进行DNA杂交,最后通过放射显影或其他显色技术来表达DNA的多态性.RFLP多态性主要是由于DNA序列中单碱基的替换、DN段的插入、缺失、易位和倒位等引起,而小卫星则是重复序列数目的差异性产生.RFLP标记是发现最早、具有典型代表的DNA分子标记技术.
1RFLP分子标记
RFLP分子标记技术由Grozdicker等人于1974年首创,其全称是RestrictionFragmentLengthPolymorphi,简称RFLP,1980年Botstein利用这种标记构建遗传图谱[1].
1.1RFLP的基本概念
DNA是绝大多数生物（少数RNA病毒除外）携带和传递遗传信息的载体,它的基本结构是由脱氧核苷单磷酸通过3’,5’磷酸二酯键连接而成的高聚物.限制性内切酶是一种能识别特定的核苷酸顺序并在这些位点上切断DNA分子的DNA内切酶,如限制性内切酶EcoRⅠ能识别6个核苷酸序列：5’-G↓AATTC-3’,它在↓处切割DNA双链.DNA分子中能被限制性内切酶识别的位点越多,它就越频繁地被切割,形成各种长度的DN段,这些片段被称为限制性片段.通过电泳可以将不同长度的DN段在凝胶中分开.然后利用Southern技术转移将这些分布在凝胶上的DN段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上.再利用同位素或非同位素标记的DNA探针与膜上的DN段杂交,即可获得与探针DNA序列互补的DN段的多态性,即限制性内切酶酶切片段的多态性（简称RFLP）,它是目前应用最为广泛的基于Southern技术的分子标记.在RFLP研究中,可以用作探针的DNA序列包括：特定基因的DN段、各种反转录DNA（cDNA）、随机的基因组DNA和人工合成的DNA寡核苷酸[2].
1.2RFLP的基本原理
RFLP实际上是不同生物体遗传物质核苷酸排列顺序的差异性的反映.作物的种间、品种间甚至个体间的遗传上的差异,其本质在于分子水平上DNA序列的差异,这是由于在进化和生长过程中染色体DNA核苷酸排列顺序发生了变化.DNA核苷酸顺序的变化导致各自DNA限制性酶切位点不同,经限制性内切酶切割DNA分子所得片段的大小和长度也就不同,这样就形成了限制性片段长度多态性,即RFLP.
RFLP的产生基本上有2种途径：一是由于在限制性内切酶识别位点上发生了单个碱基替换,使这一限制性位点丢失或获得而产生RFLP,人们称之为单碱基突变型,也称点多态性；另一途径是由于DNA内部发生较大的顺序变化而产生的,称为结构重排型.结构重排型还可进一步分为两类：一类是由于DN段的插入、缺失或倒位等原因,导致限制性酶切位点的相对转移,从而产生RFLP；另一类是由多个重复串联序列组成的高变区引起的.这些高变区一般位于基因的附近,在不同的个体中高变区所串联的重复顺序拷贝数相差悬殊,因此,高变区的长度变化很大,从而使高变区两侧限制性酶切位点的固定位置随高变区而发生相对位移,从而产生RFLP[2].
1.3RFLP检测和分析过程
利用限制性内切酶消化高等植物的染色体DNA会产生大量不同长度和大小的DN段,长度不同的片段可通过凝胶电泳将它们分开.但是由于高等植物的DNA经酶切后产生不同大小的片段数太多,在凝胶上就成为一片.经过电泳虽能将它们分开,却无法分辨特定的片段,需要用染色体DNA的小片段作为探针进行DNA—DKA分子加以检测,探针DNA和凝胶上的DNA必须单链.为了便于杂交,所有DNA通过Southern印迹法从凝胶转移到固相支撑物上,如硝酸纤维膜或尼龙膜,然后用同位素标记的探针与滤膜上的DNA杂交,通过放射自显影加以检测[2].
1.4RFLP技术在品种鉴定中的应用
理论上讲,每一个品种就是一种基因型,通过分析,大多可以找到相对应的RFLP指纹图谱（可以有多个限制性内切酶或探针组合）,利用这个RFLP指纹图谱就可将这个品种与其他品种或混杂株区分开来.因此,提取某个品种的单粒种子或不同品种的DNA,用特定的限制性内切酶酶切DNA,将大小不同的DN段用凝胶电泳分离,把凝胶中的DNA转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,再用经放射性同位素（如32P等）或非放射性物质（如地高辛等）标记的探针进行杂交,经放射自显影后即可在X光胶片上观察到待鉴定品种的RFLP指纹,经与标准RFLP指纹的比较分析,就可对该品种进行验杂和验伪.可见,RFLP分析有赖于限制性内切酶和探针的种类及其组合.目前,已分离到的限制性内切酶达200种,均有其特定的识别位点,识别碱基数从4～10个,定位的水稻RFLP标记已达3500个.任一座位上的碱基均存在着被其他碱基替换的可能性,从而导致限制性酶切位点的丧失或成为其他限制性酶切位点.因此,只要限制酶选择得当,均可鉴定到该品种的DNA限制性片段长度多态性[3].
RFLP标记的主要特点有：
1）遍布于整个基因组,数量几乎是无限的.
2）无表型效应,不受发育阶段及器官特异性的限制.
3）共显性,可区分纯合子和杂合子.
4）结果稳定、可靠.
5）DNA需要量大,检测技术繁杂,难以用于大规模的育种实践中.
在常用的水稻DNA标记中,RFLP标记是最早发现并应用于图谱构建和基因定位的分子标记,1988年,美国康乃尔大学利用RFLP标记构建了由135个座位组成的第一张水稻分子标记连锁图,揭开了水稻数量分子遗传学的序幕.1994年康乃尔大学和日本水稻基因组计划又分别报道了以RFLP标记为基础的水稻致密连锁图,为水稻基因组测序计划以及基因定位研究提供了极大便利[4].Wang等（1989、1992）用150个探针组合对70个水稻品种进行RFLP分析,随后他们又用25个探针对来自稻属21个种的93个品种编号,通过RFLP分子进行稻属分类和品种鉴定.毛龙等对高秆野生稻与栽培稻杂交后代的RFLP进行了分析[5].王志民等（1996）用高度多态性探针gFM31对59个谷子品种（包括地方品种、育成品种及品系）进行DNA指纹分析,共鉴别出58种类型[6].
因此,RFLP标记法被认为是目前进行品种真实性与纯度鉴定的最可靠的方法之一,但分析过程比较繁琐,成本昂贵,不能用于大批量杂交种的纯度鉴定,在亲缘关系较近的杂交水稻栽培品种之间RFLP的多态位点较少,尤其在系谱分析中所提供的信息不够充分（Jeffreysetal.,1985）,在亲缘关系较近的水稻栽培品种之间RFLP的多态性更低,几乎难以用RFLP技术进行品种鉴定（Akagietal.,1997；Rongwenetal.,1995）,且过程中须使用同位素处理,应用于种子检测难度较大,大大限制了RFLP技术在实际中的应用[7].
2小卫星（minisatellitesDNA）标记
小卫星DNA是串联重复序列（VariableNumberofTandemRepeat,简称为VNTR）的一种,为一种重复DNA小序列,由串联重复的核心序列组成,主要分布于染色体近端粒区和着丝粒区.小卫星一般长度为十几到几十个碱基对（bp）组成,重复次数不等,一个小卫星DNA的总长度,可从几十个bp到几千个bp.小卫星遵循孟德尔共显性遗传方式[8].
小卫星最早在1980—1984年由人类遗传学家相继在人体基因组中发现,Wyman等（1980）认为,在人体基因组中含有高变区（HyperVariableRegions.HVRs）,并证明这些高变区是一些串联重复序列[9].Jeffreys等（1985）发现,重复序列中重复单位的核心序列是相似的,在真核基因组中具有多等位性、高丰富性和极强的保守性,在不同个体之间存在有串联数目的差异,这种多态性可能是在DNA复制或不等交换过程中发生的.植物上自1988年起也进行了广泛研究,Dallas（1988）用人类小卫星探针成功地检测了6个栽培水稻品种的DNA指纹,发现同品种内不同植株的DNA指纹图是相同的,而不同品种有相同DNA指纹图的可能性仅为10×10-17[10].关于小卫星的产生,多数学者认为是DNA复制或修复时,滑动链与互补链碱基错配,导致一个或几个重复单位的插入或缺失,因而在不同个体或不同种群间产生长度多态性[8].
小卫星DNA多态性很高,但是探针缺乏.研究者不得不自己合成探针或利用人类基因组研究中获得的DN段与作物DNA杂交,以Southern转移为基础,实验周期较长[11].因此,小卫星DNA一般与RFLP技术结合以获得小卫星DNA指纹图谱,即用小卫星DNA作探针进行Southern杂交.与RFLP相比,一个小卫星探针一次能检测到10～20个高度多态的位点,使多态信息含量（PIC）升至0.7～0.9之间,但小卫星DNA指纹的缺点限制了它的应用,一方面,技术上存在与RFLP技术一样的缺点,另一方面,它在染色体上分布不均匀,不利于连锁分析,再就是小卫星探针比较长,难以获取,而且数量有限[8].
目前小卫星标记技术更多是应用在医学和动物的亲子鉴定上,在植物上尤其是在水稻上的研究应用不多,更多是被微卫星（SSR）技术代替.
参考文献：
[1]屈长荣.种子检验技术[M].天津：天津大学出版社.2011：157-158.
[2]李梅芳,周开达.水稻生物技术育种[M].北京：中国农业科技出版社.2001：239-240.
[3]方宣钧,刘思衡,江树业.品种纯度和真伪的DNA分子标记鉴定及其应用[J].农业生物技术学报.2000,8（2）：106-110.
[4]庄杰云.水稻DNA分子标记的特点与应用[J].中国稻米.2008（1）：3-4.
[5]张凤,陈伟.杂交水稻种子纯度鉴定方法概述[J].种子.2004（9）：55-56
[6]王志民,刘春吉,王润奇.用gFM31探针进行谷子品种的指纹分析[J].遗传学报.1996,23（3）：228-233.
[7]汪爱顺,李进波,刘汉珍.DNA指纹用于杂交水稻种子纯度和真伪鉴定的研究进展[J].分子植物育种,2005（3）：393-400.
[8]刘长国,罗军,杨公社,等.DNA标记技术研究进展[J].黄牛杂志.2001（6）：41-42.
[9]许云华,沈洁.DNA分子标记技术及其原理[J].连云港师范高等专科学校学报.2003（3）：78-81.
[10]郑成超,温孚江.DNA分子标记技术与作物品种纯度鉴定[J].东农业大学学报,1997（4）：501-502.
[11]钱惠荣,郑康乐.DNA标记与分子育种[J].生物工程进展.1998,18（3）：12-18.
基金项目：宁波市科技局农业择优项目（2012C10017）.
标记论文范文结:
大学硕士与本科标记毕业论文开题报告范文和相关优秀学术职称论文参考文献资料下载，关于免费教你怎么写标记方面论文范文。